环境DNA宏条形码重新揭示濒危地中海鳉鱼Aphanius iberus的分布更新及其保护意义

《Environmental DNA》：Rediscovering the Endangered Mediterranean Killifish Aphanius iberus: Environmental DNA Reveals Updated Distribution and Conservation Implications in Coastal Habitats

　　

水生生态系统是地球上生物多样性最丰富、生态意义最重要的栖息地之一。尽管如此，它们正日益受到栖息地退化和生物入侵的威胁。在欧洲，地中海沿岸的集约化农业和城市化破坏了水文连通性，并改变了水生动物群的自然栖息地。受影响最严重的物种之一是濒危的西班牙牙鳉（Aphanius iberus），这是一种特有的西班牙地中海沿岸小型广盐性鳉鱼。其种群局限于破碎化的栖息地，面临环境压力，特别是与入侵性东部食蚊鱼（Gambusia holbrooki）的竞争。评估西班牙牙鳉的分布对其有效的保护管理至关重要；然而，传统方法劳动密集、具有侵入性，且往往无法检测到低丰度物种。因此，研究人员采用靶向线粒体^12S rRNA基因的环境DNA（environmental DNA，eDNA）宏条形码（metabarcoding）方法，重新评估其分布。从2022年至2024年，在涵盖该物种当前分布点、再引入点及历史分布点的16个位点采集了135份水样。采样沿地中海沿岸于秋季和春季进行，生境类型包括淡水、半咸水和盐水。研究结果确定了西班牙牙鳉的种群据点，并确认了近期再引入措施的成功，尤其是内陆Villena种群。整个监测期间伴生鱼类群落保持稳定，入侵性东部食蚊鱼在所有位点均有检出。在历史分布点（特别是Guardamar del Segura）检出西班牙牙鳉，凸显了eDNA在识别传统方法难以发现的残余种群方面的敏感性。然而，低序列读数和零星出现再次确认了该物种的濒危状态，强调需要频繁监测，并整合栖息地恢复和入侵物种控制。总体而言，研究结果突出表明eDNA宏条形码是监测西班牙牙鳉的一种高效、非侵入性方法，能够在面临类似环境挑战的过渡栖息地中推进受威胁水生动物群的保护工作。

**解读文章**

水生生态系统覆盖地球表面三分之二以上，支撑着极高的生物多样性和关键生态功能，但正因栖息地退化和生物入侵而迅速丧失。在欧洲，地中海沿岸集约农业与城市化切断了水文连通性，改变了水生动物自然栖息地。西班牙牙鳉（Aphanius iberus）是伊比利亚半岛地中海沿岸特有的濒危广盐性鳉鱼，其野生种群已退缩至破碎化的滨海湿地、灌溉渠等人工或半自然生境，并面临入侵性东部食蚊鱼（Gambusia holbrooki）的强烈竞争。传统鱼类监测方法（如电捕、网具）依赖可涉水水域和分类学专家，在导电率高的半咸水与盐水环境中效率低下，且具侵入性，易对濒危物种造成伤害，同时难以检出低丰度种群。为了准确评估西班牙牙鳉当前分布、验证再引入成效并刻画栖息地鱼类群落，研究人员采用环境DNA（eDNA）宏条形码技术，靶向线粒体^12S rRNA基因，对伊比利亚半岛地中海沿岸该物种的当前、再引入及历史分布位点进行了系统监测。

**研究方法（不超过250字）**
研究人员在2022—2024年秋季和春季（A22、S23、A23、S24）沿地中海沿岸16个位点采集135份水样，覆盖淡水、半咸水与盐水生境，包括沼泽、河口、河流及灌溉渠。现场过滤水样获得eDNA，提取DNA后扩增^12S rRNA基因220 bp片段（MiFish引物），经两步PCR引入索引并在Illumina NovaSeq 6000测序。参考数据库包含2882种鱼类，并纳入来自MNCN-CSIC组织与DNA生物库的69个西班牙牙鳉标本所生成的10个单倍型，以增强物种鉴定能力。生物信息流程包括FLASH2拼接、Cutadapt去引物、QIIME2质控、DADA2降噪获得扩增子序列变异体（ASV），物种分配阈值≥99%（种级）和97–98%（属级），未匹配序列经BLASTn比对NCBI GenBank。采用负二项广义线性模型评估牙鳉与食蚊鱼序列读数的关系。

**研究结果**
**3.1 扩增子序列变异体（ASV）鉴定**
四个采样期分别检测到159、204、234和318个ASV，其中鱼类ASV在属级和种级水平均有分配；未匹配鱼类的序列经BLASTn揭示来自两栖类、鸟类、哺乳类及爬行类。多个ASV对应同一物种，反映了种内单倍型变异。该结果表明eDNA宏条形码能有效区分鱼类与非鱼类DNA，并捕获遗传多样性。

**3.2 濒危西班牙牙鳉的检测**
除Prat de Cabanes-Torreblanca自然公园外，所有当前分布点均检出西班牙牙鳉；Pe?íscola沼泽连续检出且读数超过3000，而Salou仅一次且读数极低（n=5），El Hondo自然公园仅在邻近灌溉渠检出一次（n=1203）。再引入位点中，Villena和Sax持续检出高读数（n>38000），Vinalopó亦证实成功（n>1000）；Albufera de Valencia自然公园仅在S24微生境（ullal）检出低读数（n=8），Grao de Castellón从未检出。历史位点中，Albuixech、Massamagrell和Guardamar del Segura均被检出（读数分别为18、6和21），证明eDNA能发现传统监测遗漏的残存种群；而Pego-Oliva、Chícamo和Huerta de Murcia未检出。

**3.3 西班牙牙鳉栖息地鱼类群落**
共检出28种鱼类，历史位点Albuixech、Pego-Oliva和Guardamar del Segura物种丰富度最高，而再引入的Villena和Sax最低。入侵性东部食蚊鱼分布最广，所有位点均存在，且在Grao de Castellón、Albuixech和Salou呈高读数。负二项广义线性模型未达统计显著，但序列读数呈现牙鳉与食蚊鱼此消彼长的趋势。历史位点还检出多种其他入侵鱼类（如Alburnus alburnus、Lepomis gibbosus等）。当前位点以本地种和特有种为主，包括极度濒危的欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）和濒危的瓦伦西亚鳉（Valencia hispanica）；半咸水/盐水生境中检出Atherina boyeri、Chelon labrosus、Dicentrarchus labrax等。另检出数种常见食用海鱼，可能来自附近城市污水或食物残留污染。

**讨论与结论**
研究人员通过eDNA监测确认了Pe?íscola作为关键种群据点，并验证了Villena、Sax和Vinalopó再引入成功。在历史位点（Albuixech、Massamagrell、Guardamar del Segura）的零星检出表明残余种群依然存在但极为脆弱。Cabanes自然公园未检出以及Salou、El Hondo等地位读数或缺失，暗示这些种群比预期更濒危。入侵食蚊鱼的广泛存在及其与牙鳉读数的反向趋势，支持该入侵种对牙鳉的负面竞争效应。研究结论部分可翻译为：本研究表明，eDNA是一种敏感、非侵入性的监测工具，成功应用于濒危西班牙牙鳉的分布评估和再引入效果检验，并能在历史栖息地中识别残存个体，但低序列读数和偶然出现重申了其濒危状态。保护策略应优先考虑栖息地恢复和入侵物种管理，尤其是对东部食蚊鱼的控制，以保障这一地方性特有种的长期存续。