根管微生物组的地理变异与核心特征：基于16S rRNA基因测序的跨国家比较研究

《INTERNATIONAL ENDODONTIC JOURNAL》：Geographic Variation and Core Signatures of the Root Canal Microbiome: A Cross-Country Comparative Study

目的：根管感染（root canal infection）包含复杂的微生物群落，可能因地理人群而异。本研究旨在比较西班牙、瑞典和美国的根管微生物组（root canal microbiome），识别关键微生物类群、组成与功能差异以及队列相关的微生物特征。

方法：从三个地理队列（西班牙n=32，瑞典n=14，美国n=25）获取原发性根管感染的16^S rRNA基因测序（16S rRNA gene sequencing）数据集。所有样本均靶向V3-V4高变区，并使用Illumina MiSeq平台测序。评估α多样性（alpha diversity）和β多样性（beta diversity）指标以评价样本内和样本间的变异。表征分类组成，随后进行差异丰度分析和核心微生物组识别。使用SPRING方法（Semi-Parametric Rank-based correlation and partial correlation estimation）推断微生物共现网络（co-occurrence network），并基于特征向量中心性（eigenvector centrality）识别枢纽类群。

结果：基于Chao1指数和观测丰富度，观察到队列间微生物丰富度存在显著差异。β多样性分析显示，人群间微生物群落分离具有统计学意义但程度中等（R²=6.8%），队列间存在大量重叠。Bacillota、Bacteroidota、Fusobacteriota和Actinomycetota在各队列中占优势，尽管其相对丰度有所不同。核心微生物组分析在属和种水平上识别出共有和队列相关的类群。基于SPRING的共现网络识别出队列相关的枢纽类群，包括美国的Fretibacterium fastidiosum、西班牙的Dialister pneumosintes和瑞典的Treponema denticola。此外，预测性功能分析提示地理队列间的微生物功能潜力存在差异。

结论：虽然根管感染共有核心微生物组，但识别出了细微的人群特异性微生物特征。然而，适度的效应量表明，仅地理变异可解释微生物组成中的有限比例。需要更大规模和更均衡的研究，以进一步评估地理因素对根管微生物组的影响及其潜在的临床相关性。

原发性根管感染（primary root canal infection）是全球重要的口腔健康负担，与根尖周炎（apical periodontitis）密切相关。研究显示全球约52%的成人至少有一颗牙受根尖周炎影响，但患病率在不同地区差异很大（16%–86%）。根管内的微生物群落高度复杂，传统培养法仅能检测约40%–50%的细菌，靶向PCR也只能覆盖预先选定的类群；高通量测序技术则揭示了以厌氧菌为主的多样化群落。已有证据表明，地理和种族因素可能塑造口腔微生物组成，但针对不同国家根管微生物组的直接比较研究仍然有限。为此，研究人员整合了西班牙、瑞典和美国三个地理队列的原发性根管感染16S rRNA扩增子测序数据，采用统一的生物信息流程，系统比较根管微生物组的多样性、组成、核心类群、共现网络和预测功能，以识别保守的核心微生物组和人群特异性微生物特征。

研究人员发现，尽管存在保守的核心根管微生物组，但三个国家队列之间表现出适度的地理相关微生物变异。具体而言，瑞典队列的微生物丰富度显著高于西班牙和美国，β多样性分析显示群落组成差异显著但效应量较小（R²=6.8%）。核心微生物组分析确定了跨国家共享的物种和属，同时各队列也拥有独特的差异丰度类群和网络枢纽类群。预测功能分析进一步提示不同队列在代谢、细胞壁合成和抗菌素耐药等通路上存在差异。这些结果揭示了根管微生物组中地理因素的作用，强调在口腔微生态研究中需考虑人群背景，并为未来精准牙髓治疗策略提供了流行病学线索。

在方法上，本研究是一项基于公共数据的二次整合分析。原始样本来自西班牙（n=32）、瑞典（n=14）和美国（n=25）三个队列，均为原发性根管感染样本，测序靶向16S rRNA基因V3-V4区，采用Illumina MiSeq平台双端测序。原始数据从ENA-EBI数据库获取，对应BioProject编号PRJNA1054361、PRJNA1175460、PRJEB61279和PRJNA757683。生物信息分析使用QIIME2流程进行质控、拼接、去嵌合和操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类（99%相似度），并基于扩展版人类口腔微生物组数据库（expanded Human Oral Microbiome Database，eHOMD）进行分类注释。α多样性采用Chao1、观测OTU数、Shannon和Inverse Simpson指数评估；β多样性采用中心对数比（centered log-ratio，CLR）变换后的欧氏距离和置换多元方差分析（PERMANOVA）检验。差异丰度分析使用线性判别分析效应量（LEfSe）；微生物共现网络采用SPRING方法推断，并以特征向量中心性识别枢纽类群；功能预测使用PICRUSt2并注释MetaCyc通路。

3.1 患者特征与测序质量评估：研究人员最初纳入83例样本（西班牙33例、瑞典25例、美国25例），质控后保留71例（西班牙32例、瑞典14例、美国25例）。队列间存在显著的年龄差异，其余临床特征（性别、牙位、叩痛、窦道）无显著差异。最终获得738个OTU，分类为12门、21纲、38目、74科、118属和278种。

3.2 国家特异性α丰富度与群落组成差异：基于Chao1和观测OTU丰富度，三个队列的微生物丰富度存在显著差异，瑞典样本丰富度最高；而Shannon和Inverse Simpson指数无显著差异。β多样性分析显示群落组成差异显著但效应量较小（R²=6.8%），队列间存在较大重叠；临床和人口学协变量与群落组成无显著关联。

3.3 各国微生物分类组成：门水平上，Bacillota、Bacteroidota、Fusobacteriota和Actinomycetota在各国均为优势菌门，其中Bacillota最丰富。科水平上，西班牙队列以Peptoniphilaceae（13.4%）为主，瑞典队列以Prevotellaceae（14.8%）为主，美国队列以Veillonellaceae（18.7%）为主。

3.4 各国共享核心微生物组：以50%检出率和0.1%相对丰度为阈值，Dialister invisus和Fusobacterium animalis在三个国家中均为核心共有物种；属水平上Olsenella、Mogibacterium、Dialister、Segatella和Fusobacterium在三国间持续存在。

3.5 各国差异丰度：LEfSe分析（LDA>3.0，p<0.05）显示，西班牙队列富集Enterococcus faecalis、Filifactor alocis、Dialister pneumosintes等；瑞典队列富集Streptococcus intermedius、Streptococcus mutans、Eikenella corrodens等；美国队列富集Fusobacterium sp.和Arachnia propionica。

3.6 网络分析揭示不同队列核心微生物类群：SPRING共现网络显示，西班牙和美国的网络包含较大连通成分（94%和86%节点），瑞典网络则较碎片化（42%节点）。枢纽类群因队列而异：美国以Fretibacterium fastidiosum、Porphyromonas endodontalis等为核心，西班牙以D. pneumosintes、F. alocis等为核心，瑞典以Treponema denticola、Hornefia nodatum等为核心。网络比较显示瑞典队列与其他队列的多项拓扑属性差异显著，但瑞典样本量较小，需谨慎解读。

3.7 功能通路：PICRUSt2预测了378条MetaCyc通路，其中28条（7.4%）在三国间显著差异。瑞典队列富集水杨酸、甲苯等降解通路和腺苷钴胺素生物合成及多粘菌素抗性；西班牙队列富集甲基酮生物合成和分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物生物合成；美国队列富集L-谷氨酸降解和L-精氨酸生物合成II。

讨论部分指出，地理因素对根管微生物组成的影响具有统计学意义但效应有限，且与已知的临床和人口学变量无关。核心类群（如D. invisus和F. animalis）的跨国家存在支持根管感染存在保守的微生物基础。差异丰度类群和网络枢纽可能反映地理、饮食、采样或技术因素，不能直接视为确定性生物标志物。功能预测仅代表潜在功能而非实际表达，且二次分析受原始队列间临床方案差异和样本量不均衡的影响。

研究结论可概括为：尽管根管微生物组存在以D. invisus、F. animalis以及Olsenella、Mogibacterium、Dialister、Segatella和Fusobacterium等属为代表的保守核心，但地理队列间在群落组成、微生物关联网络和预测功能方面表现出适度变异。这些发现提示地理背景是根管微生态研究中的潜在混杂因素，未来需更大规模、多中心且临床信息完整的研究来评估其生物学和临床意义。