冷大气等离子体对模拟废水中大肠杆菌GW-AmxH19转录组与蛋白质组的时间分辨效应

《PROTEOMICS》：Time-Resolved Effects of Cold Atmospheric Plasma on E. coli GW-AmxH19 Transcriptome and Proteome in an Emulated Wastewater Environment

专业翻译
冷大气等离子体（cold atmospheric plasma, CAP）对多种微生物具有杀灭效果。本研究描述了物理等离子体处理对一株分离自医院废水的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株的影响。研究人员将E. coli GW-AmxH19接种于人工废水中，并接受CAP处理15分钟。在24小时内的不同时间点监测转录组和蛋白质组，以区分即时生理响应与恢复阶段的适应性变化。存活菌落数平均减少90%。存活细胞对物理等离子体的短期响应旨在修复和保护细胞结构免受等离子体诱导的损伤，该损伤主要由活性氧和氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS）引起。值得注意的是，CAP诱导了携带抗生素耐药决定簇的接合性质粒上基因的暂时性转录。恢复阶段的晚期响应以两个原噬菌体的大量激活为主，这使冷等离子体处理成为诱导原噬菌体裂解周期的一种潜在新策略。本研究首次以时间分辨方式联合分析了CAP对一株环境细菌分离株的转录水平与翻译水平效应。文中描绘并讨论了将CAP作为污水处理厂额外净化步骤以减少病原体和抗生素耐药性向环境中传播的机会与风险。

论文解读

**一、研究背景与科学问题**

抗生素耐药性（antimicrobial resistance, AMR）已成为全球重大公共卫生威胁。2019年，全球约有近500万例死亡与细菌性AMR相关，其中约100万例直接归因于AMR；预计到2050年，AMR相关死亡人数可能达到1000万。污水处理厂（wastewater treatment plant, WWTP）是抗生素耐药菌产生和传播的重要热点区域：其接收来自家庭和医院的生活污水，其中不仅含有潜在致病性和/或耐药性细菌，还含有浓度不等的抗生素残留。WWTP中丰富的营养条件和因微生物聚集成细菌絮体而形成的高细菌密度，有利于水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT），从而可能促进抗生素耐药基因的交换。此外，废水中亚抑制浓度的抗生素残留可能选择性地促进耐药菌的生长，使其竞争过敏感菌。尽管常规处理过程通常能降低细菌负荷，但仍有部分“问题”微生物能够存活并随出水释放到受纳水体中，导致病原菌和耐药菌在环境中扩散，并可能重新传播给人类和动物。为降低处理废水的细菌负荷及耐药菌传播风险，高级氧化过程（advanced oxidation processes, AOP）如臭氧和紫外线照射已被探索或应用。冷大气等离子体（cold atmospheric plasma, CAP）作为AOP的一种，已被证明能有效灭活细菌、真菌及耐药微生物，并可降解抗生素和全氟辛酸等难降解污染物。然而，目前关于等离子体基于废水净化的潜力与可能风险知之甚少，特别是其对环境细菌分离株的长期分子生理效应缺乏系统研究。

**二、研究目的与技术方法**

本研究旨在以时间分辨方式全面解析CAP处理对从医院废水中分离的大肠杆菌GW-AmxH19菌株的转录组和蛋白质组的影响，从而深入了解细菌对物理等离子体的应激响应和恢复适应机制。研究人员在人工模拟废水中培养该菌株，并使用针-液放电等离子体源处理15分钟，在多个时间点（处理前、处理后0小时、0.5小时、2.5小时和24小时）采样，获取转录组和蛋白质组数据。该研究使用了多项关键技术方法：转录组测序采用Illumina NovaSeq平台，蛋白质组分析采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），数据经DESeq2和DEqMS等工具进行差异表达分析，并通过多维标度（MDS）和对应分析进行样品全局模式可视化。此外，研究还结合多种生物信息学工具进行基因功能注释、调控子分析、抗生素耐药基因鉴定和原噬菌体区域预测。实验设置包含三份生物学重复，培养基在30分钟时进行更换以模拟真实废水处理中水流稀释效应并促进细菌恢复生长。

**三、主要研究结果**

**1. 等离子体处理对细胞生长与存活率的影响**
研究人员发现，等离子体处理后的E. coli GW-AmxH19活菌数平均减少90.16%。光密度（OD₅₀₀）测量显示，处理组与对照组之间细胞密度差异较小，但对照组最终OD值较高。结果表明，中等剂量的等离子体暴露能够有效灭活大部分细菌，但仍有部分存活细胞能够恢复生长。

**2. 转录组对等离子体处理的响应**
共30个转录组样本中鉴定到1,363个差异表达基因，可分为早期响应（0小时和0.5小时，161个基因）、延迟响应（2.5小时，772个基因）和晚期响应（24小时，273个基因）。早期响应表现为DNA保护和错配修复基因、血红素生物合成基因、铁和锰摄取基因的快速诱导，以及超氧化物和一氧化氮应激调控子（soxS、nsrR、fur）的激活。延迟响应以噬菌体休克蛋白、细胞色素bd-II氧化酶、多药耐药外排泵、铁载体运输系统及质粒上接合装置和抗生素耐药基因（TEM β-内酰胺酶、四环素耐药）的大量转录为特征。晚期响应则表现为两个完整原噬菌体基因簇（Siphoviridae家族和Myoviridae家族）的高水平表达，以及荚膜异多糖酸生物合成、O-抗原合成恢复和多种SOS响应基因的诱导。

**3. 调控子水平的相关性分析**
通过对应分析密度双标图，研究人员识别出多个与等离子体处理正相关的调控子，包括BglJ、LeuO和StpA调控的芳香族糖苷转运系统，EvgA调控的应激耐受基因，OxyR、NsrR和Zur调控的氧化应激和厌氧适应基因，以及SlyA和RcsB调控的生物膜形成和荚膜合成相关基因。

**4. 蛋白质组对等离子体处理的响应**
共鉴定到1,061个蛋白质。与转录组模式相似，蛋白质组在2.5小时出现最多差异表达蛋白（91个）。早期蛋白质响应以吡哆醇5′-磷酸氧化酶PdxH、NADH-醌氧化还原酶亚基NuoI、硫氧还蛋白系统TrxA/TrxB、甲硫氨酸亚砜还原酶MsrC及铁硫簇蛋白等上调为特征，表明翻译水平上的快速防御是应对等离子体损伤的第一道防线。延迟响应中，酸应激相关蛋白（HdeA/HdeB、GadC、MdtE/MdtF）、谷氧还蛋白GrxC和黄素蛋白NfsB等持续上调。晚期响应中，噬菌体休克蛋白PspA显著高表达，同时多种氨基酸分解代谢酶、甲基柠檬酸途径关键酶和糖异生相关蛋白PckA上调，显示细胞进入恢复和代谢重建阶段。

**四、讨论与结论**

研究讨论指出，CAP的抗菌效果主要源于活性氧和氮物种（RONS）引起的生物大分子氧化损伤。存活细胞的短期防御依赖于转录和翻译水平的协同调控，其中翻译水平的快速上调（如UspD、TrxA/TrxB、MsrC等）构成第一道防线。长期恢复阶段伴随酸应激响应、铁和锰转运系统的加强以及生物膜形成相关基因的上调，反映了细胞对持续应激的适应性重塑。值得关注的是，CAP处理诱导了携带抗生素耐药基因的接合性质粒的转录激活，提示其可能增加HGT和耐药性传播的风险；同时，CAP也显著诱导了两个原噬菌体的裂解周期，这有望成为消除顽固细菌的一种新策略。结论部分指出，冷大气等离子体是一种有前景的废水处理改进技术，除直接杀菌外还能降解抗生素等药物。然而，其在传播抗生素耐药决定簇方面（经由可 mobilized 质粒和噬菌体）的潜在风险需进一步研究，CAP处理对受纳水体及生态系统的影响也有待深入评估。