纵向转录组学揭示EGFR突变肺腺癌从早期到转移进展的分子程序

《Lung Cancer》：Longitudinal transcriptomic profiling of paired early and metastatic EGFR-mutant lung adenocarcinomas reveals molecular programs associated with disease progression

背景：驱动表皮生长因子受体（EGFR）突变肺腺癌（LUAD）从局限性向转移性疾病进展的分子机制尚不完全清楚。本研究旨在通过分析来自早期和后续转移性EGFR突变LUAD患者的纵向配对肿瘤样本，表征与疾病进展相关的转录组改变。 方法：研究人员对在可切除疾病阶段（IB–IIIA期）和进展至IV期后获得的八对肿瘤样本进行了全转录组测序。进行了差异基因表达、通路富集和肿瘤微环境分析。进一步利用弹性网络正则化Cox回归在癌症基因组图谱肺腺癌（TCGA-LUAD）队列中评估了进展相关基因的预后价值，并在独立转录组队列（GSE50081）和临床蛋白质组肿瘤分析联盟肺腺癌（CPTAC-LUAD）蛋白质组数据集中进行了验证。 结果：比较转录组分析在早期和转移性肿瘤之间鉴定出445个差异表达基因。早期肿瘤富集于发育、组织重塑、缺氧反应和表面活性剂代谢程序，而转移性肿瘤则显示出与代谢适应、跨膜转运、细胞外基质重塑、补体和凝血信号传导、血小板活化和外源物代谢相关的通路富集。在疾病分期之间未观察到推断的免疫细胞组成存在显著差异。由进展相关基因衍生的19基因特征在TCGA-LUAD中分层了总生存期（OS）（风险比HR 2.53，95%置信区间CI 1.86–3.44，p < 0.0001），且在调整临床病理变量后仍保持独立预后价值。该特征的预后价值在GSE50081中得到确认（HR 2.12，95% CI 1.20–3.74，p = 0.0083），并在CPTAC-LUAD的蛋白质水平上得以重现。 结论：对配对早期和转移性EGFR突变LUAD的纵向转录组分析揭示了与疾病进展相关的显著分子重编程。代谢适应、转运相关通路、细胞外基质重塑和凝血相关信号被确定为晚期疾病的关键特征。这些进展相关的分子程序在独立的转录组和蛋白质组队列中均显示出预后相关性。

研究背景与科学问题

肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是非小细胞肺癌最常见的组织学亚型，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。表皮生长因子受体（EGFR）基因激活突变定义了LUAD中一个临床和生物学独特的亚群，在西方患者中发生率约10-15%，在亚洲患者中高达50%。尽管EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的应用显著改善了晚期EGFR突变非小细胞肺癌的临床结局，且近期临床试验已将靶向治疗扩展至新辅助和辅助治疗领域，但相当比例的患者最终仍会经历疾病复发或进展。因此，阐明驱动肿瘤进展的生物学机制成为亟待解决的科学问题。

目前，大多数分子研究聚焦于基线肿瘤特征分析或EGFR靶向治疗后获得性耐药的机制，导致驱动阶段特异性进展的生物学过程仍不明确。特别是，利用同一患者不同疾病阶段的配对肿瘤样本进行纵向研究极为稀缺，而这种设计具有独特优势，能够最大限度地减少患者间异质性，直接捕捉与肿瘤演变相关的分子变化。转录组分析可捕获基因组无法直接编码的动态生物学过程，如代谢适应、细胞可塑性、细胞外基质重塑以及与肿瘤微环境的相互作用。这些转录改变可能先于临床进展发生，促进转移能力、治疗耐药和不良临床结局。基于此，研究人员假设EGFR突变LUAD的进展是由可重复的转录重编程驱动的，这种重编程反映了高度侵袭性肿瘤表型的获得。

研究方法与技术路线

为验证上述假说，研究人员开展了一项回顾性单中心研究，纳入2008年1月至2024年7月在德国海德堡大学医院胸科诊所诊断和治疗的EGFR突变非小细胞肺癌患者。研究人员对来自8例患者的16份配对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本（分别取自早期可切除阶段IB-IIIA期和进展至IV期后）进行了全转录组测序。关键分析方法包括：使用DESeq2进行差异表达分析，采用包含肿瘤分期、患者个体和病理学家估计肿瘤纯度的多变量模型；利用fgsea和MSigDB标志基因集进行基因集富集分析（GSEA）；通过clusterProfiler和ReactomePA进行基因本体论（GO）、KEGG和Reactome通路富集分析；使用MCP-counter估算免疫和基质细胞丰度。对于预后建模，研究人员将445个差异表达基因作为预定义候选基因集，在TCGA-LUAD发现队列（n=500）中应用弹性网络正则化Cox比例风险回归，优化超参数后得到19基因预后特征，并在独立队列GSE50081和CPTAC-LUAD蛋白质组数据集中进行外部验证。

研究结果

3.1 建立EGFR突变肺腺癌纵向转录组队列

研究共纳入11例EGFR突变肺癌患者，所有患者在早期阶段（手术标本）和IV期（复发小活检）均有可供全转录组测序的FFPE组织。中位确诊年龄64岁，女性占63.3%，72%为当前吸烟者。所有患者确诊后立即接受手术，63.3%接受了辅助化疗。中位复发时间为18个月。经质量控制后，共有8对早期和转移性肿瘤样本可用于纵向转录组分析，构成发现队列。

3.2 早期与晚期EGFR突变LUAD的分子差异

纵向转录组分析揭示了从早期到转移性EGFR突变LUAD进展过程中的广泛基因表达重编程。差异表达分析鉴定出445个在早期和晚期肿瘤之间存在差异的基因（|log2FC| > 1.5且FDR < 0.05），其中212个在IV期样本中上调，233个在早期肿瘤中上调。功能通路富集分析显示，早期肿瘤富集于组织重塑、肺发育、缺氧反应和单糖代谢等生物学过程；而IV期肿瘤则富集于代谢重编程、跨膜转运、ABC转运蛋白活性、外源物代谢、脂肪细胞因子和AMPK信号传导、补体和凝血级联反应以及血小板相关通路。研究人员未观察到免疫细胞群体在早期和晚期样本之间存在显著差异。

3.3 EGFR突变早期与IV期LUAD基因表达特征的预后价值

利用弹性网络Cox模型，研究人员从445个候选基因中筛选出19个具有非零系数的基因构成最终预后特征。该特征计算的风险评分在TCGA-LUAD队列中显著分层总生存期，低评分组死亡风险高于高评分组（HR=2.53，95% CI: 1.86-3.44；对数秩p < 0.0001）。在多变量Cox回归分析中，该特征仍与总生存期独立相关（HR=2.24，95% CI 1.61-3.11；p < 0.00001）。在独立GSE50081队列中的外部验证证实了该特征的预后价值（HR=2.12，95% CI 1.2-3.74；p=0.0083）。

3.4 与早期vs. IV期EGFR突变LUAD相关的预后基因的蛋白质水平验证

为评估转录组发现在蛋白质水平的反映程度，研究人员分析了CPTAC-LUAD队列的蛋白质组数据。19个预后基因中有10个可获得蛋白质表达数据，其中7种蛋白在肿瘤和正常肺组织间存在显著差异。在CPTAC-LUAD中，使用源自原始TCGA-LUAD弹性网络模型的系数计算的六蛋白风险评分显著分层了总生存期（对数秩p=0.0028），低评分组患者的总生存期显著短于高评分组（HR=3.90，95% CI: 1.50-10.15；p < 0.0001）。

讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究的纵向配对设计减少了患者间异质性，并补充了TRACERx等研究所确定的进化原则。研究发现转移性肿瘤中代谢通路的富集尤为显著，这与EGFR驱动肺癌进展和治疗耐药中代谢适应的已知作用一致。ABC转运蛋白通路、补体信号、凝血级联和血小板相关过程的富集也与先前实验和临床研究中血小板-肿瘤相互作用和凝血信号参与转移播散的发现相符。值得注意的是，仅有一例复发肿瘤获得了经典的EGFR T790M耐药突变，表明EGFR突变LUAD的进展涉及异质性的基因组和转录适应。与显著的肿瘤相关通路转录改变相反，研究人员未检测到免疫细胞群体的显著差异，这可能受限于样本量和bulk RNA测序的局限性。

研究结论：对配对早期和转移性EGFR突变LUAD的纵向转录组分析揭示了与疾病进展相关的显著分子重编程。代谢适应、转运相关通路、细胞外基质重塑和凝血相关信号被确定为晚期疾病的关键特征。这些进展相关的分子程序在独立的转录组和蛋白质组队列中均显示出预后相关性。