《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Transketolase-like 1 potentiates PD-1 blockade in hepatocellular carcinoma by glycolysis to prime dendritic cell lactylation
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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）对免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）治疗反应欠佳。为克服这一耐药性，研究人员旨在通过多组学分析描绘关键免疫耐药因子，开发阻断其免疫抑制轴的策
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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）对免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）治疗反应欠佳。为克服这一耐药性，研究人员旨在通过多组学分析描绘关键免疫耐药因子，开发阻断其免疫抑制轴的策略，并构建靶向纳米系统以增强HCC中抗PD-1治疗的疗效。利用接受抗PD-1治疗的HCC患者的转录组和蛋白质组数据，结合小鼠模型的功能验证及分子和细胞生物学机制研究，研究人员鉴定出转酮醇酶样蛋白1（transketolase-like 1, TKTL1）为一种双重属性生物标志物——其高表达虽提示较差的基础预后，却可增强对ICB的治疗反应。机制上，TKTL1将葡萄糖通量转向糖酵解而非磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP），招募USP9X去泛素化并稳定缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α），进而上调己糖激酶2（hexokinase 2, HK2）以放大糖酵解输出和乳酸积累。这一代谢重编程通过HIF-1α驱动的CCL4分泌招募PD-L1high树突状细胞（dendritic cells, DCs），同时乳酸诱导的TRIM28K408乳酸化修饰通过阻断泛素介导的降解来稳定PD-L1，从而编排双重免疫抑制回路。研究人员构建了一种肝癌细胞膜包被的MnO?纳米系统（CQLH），共递送TKTL1抑制剂和乳酸氧化酶，该纳米系统可破坏TKTL1-HIF-1α-HK2轴、耗竭乳酸并重编程肿瘤微环境，从而增强抗PD-1治疗以抑制肿瘤生长，尤其在TKTL1high肿瘤中效果显著。上述发现定义了驱动HCC抗PD-1敏感性的关键“TKTL1-糖酵解-乳酸-DC”轴，确立了TKTL1作为ICB反应的潜在生物标志物和可干预的治疗靶点，并证明靶向CQLH纳米系统可克服耐药并增强抗PD-1疗效，为TKTL1high HCC提供了一种精准免疫治疗策略。
论文解读：
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤和第三大癌症相关死亡原因，约占原发性肝癌的90%。尽管酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）如索拉非尼和仑伐替尼仍是晚期HCC一线系统治疗的重要选择，但其临床获益有限，存在生存改善幅度小、剂量限制性不良反应频繁以及数月内出现获得性耐药等问题。近年来，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）通过重新激活宿主内源性抗肿瘤免疫应答，彻底改变了癌症治疗格局。阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗成为十多年来首个在总生存期上显著超越索拉非尼的方案，将中位总生存期从13.4个月延长至19.2个月。然而，研究人员的前瞻性II期临床试验（NCT04297202）显示，可切除HCC患者围手术期使用卡瑞利珠单抗（抗PD-1）联合阿帕替尼仅达到33.3%的客观缓解率，相当比例患者在12个月内出现疾病进展。ICB耐药机制复杂，涉及肿瘤细胞和免疫系统层面的多因素相互作用，包括免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的建立、树突状细胞（dendritic cells, DCs）抗原呈递能力受损、瘤内遗传和表观遗传异质性等。值得注意的是，靶点缺失——即肿瘤细胞上PD-L1或PD-L2等关键配体的丢失或下调——已被证明是多种实体瘤中60%至85% ICI治疗失败的潜在原因。尽管PD-L1免疫组化已在非小细胞肺癌、乳腺癌和食管癌中被验证为ICI反应的预测性生物标志物，但其在HCC中的效用仍存在争议。因此，明确PD-1/PD-L1缺失的分子驱动因素并鉴定可靠的预测性生物标志物是迫切的临床需求。
基于NCT04297202前瞻性临床试验的整合多组学数据（RNA测序和蛋白质组学分析），研究人员鉴定出转酮醇酶样蛋白1（transketolase-like 1, TKTL1）为HCC抗PD-1反应的新型代谢主调控因子。TKTL1是转酮醇酶的一种亚型，是葡萄糖代谢中控制磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）非氧化分支的关键酶，在多种人类癌症中频繁过表达并与不良预后相关。然而，与既往报道相反，研究人员发现TKTL1主要通过糖酵解途径而非PPP促进HCC进展并调节免疫治疗敏感性。机制上，TKTL1招募去泛素化酶USP9X稳定缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α），后者驱动己糖激酶2（hexokinase 2, HK2）介导的糖酵解通量和乳酸积累，同时诱导HIF-1α/CCL4依赖性DC招募至TME。值得注意的是，积累的乳酸进一步触发DCs中TRIM28 K408乳酸化修饰，稳定PD-L1蛋白表达并建立局部免疫抑制状态。为治疗性靶向这一新鉴定的轴，研究人员构建了一种具有良好生物相容性和肿瘤靶向能力的仿生纳米平台，共递送新型TKTL1抑制剂（Quercetin 3-glc-7-gent）和乳酸氧化酶，协同破坏TKTL1/HIF-1α信号和乳酸驱动的PD-L1稳定化，用于HCC精准免疫治疗。
研究人员开展研究时采用了多项关键技术方法。首先，利用NCT04297202试验中抗PD-1治疗的HCC患者生物样本进行整合RNA测序和蛋白质组学分析，鉴定差异表达基因和蛋白。其次，利用98例治疗初治HCC患者的配对肿瘤及癌旁组织芯片进行免疫荧光染色，并结合TCGA数据库进行生存分析。在功能研究中，研究人员建立了C57BL/6皮下肿瘤模型、原位肝癌模型和二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine, DEN）/四氯化碳诱导的化学性HCC模型，以及免疫重建的患者来源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft, PDTX）模型。机制研究方面，采用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、质谱流式（CyTOF）、非靶向代谢组学、13C标记葡萄糖代谢通量示踪、细胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）检测、CUT&Tag、染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）、双荧光素酶报告基因、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、GST pull-down、泛素化检测、乳酸化蛋白质组学、虚拟筛选和分子动力学模拟等技术。纳米系统表征采用了透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）等方法。
研究结果部分涵盖以下核心发现。在“整合多组学分析揭示抗PD-1应答HCC患者中TKTL1上调”部分，RNA-seq和蛋白质组学分析均显示应答者中TKTL1在RNA和蛋白水平一致上调；KEGG和GO富集分析提示应答者中糖酵解/糖异生通路激活和免疫活化特征增强。组织芯片和TCGA分析显示TKTL1高表达与治疗初治HCC患者较差的总生存期（overall survival, OS）和无病生存期（disease-free survival, DFS）相关，但抗PD-1应答者表现出更高的TKTL1表达和更明显的肿瘤坏死。在“TKTL1驱动肿瘤进展同时增强抗PD-1免疫治疗敏感性而非阿帕替尼敏感性”部分，体外实验表明TKTL1敲低抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力，过表达则增强这些致癌表型；TKTL1过表达不改变细胞对阿帕替尼的敏感性。原位模型和DEN/CCl4化学诱导模型中，TKTL1过表达加速肿瘤生长但增强抗PD-1治疗反应，联合治疗减少CD8?T细胞耗竭标志物（PD-1、CTLA-4、TOX）并增强效应细胞因子IFN-γ。在“TKTL1通过糖酵解而非PPP重编程葡萄糖代谢以稳定HIF-1α/HK2/PD-L1轴并驱动HCC抗PD-1敏感性”部分，TKTL1敲低后RNA-seq显示糖酵解相关基因（HK2、HKDC1、SLC2A1）显著下降，KEGG富集于糖酵解/糖异生和HIF-1α信号通路；13C标记葡萄糖通量示踪证实敲低后糖酵解通量和乳酸产生显著减少而PPP无明显变化；ECAR和乳酸产量检测进一步验证TKTL1对糖酵解的正向调控。TKTL1敲低降低HIF-1α蛋白水平但不影响其mRNA水平，同时降低PD-L1和HK2蛋白表达；CUT&Tag和ChIP证实HIF-1α直接结合HK2启动子近端区域驱动其转录。在“TKTL1通过招募USP9X促进HIF-1α去泛素化激活HCC糖酵解途径”部分，CHX追踪实验显示TKTL1过表达减缓HIF-1α降解，MG132实验证实TKTL1通过蛋白酶体途径调控HIF-1α稳定性；Co-IP和GST pull-down证实TKTL1、USP9X和HIF-1α形成三元复合物；USP9X特异性去除K48连接泛素链稳定HIF-1α，关键泛素化位点鉴定为赖氨酸251（K251）；结构域突变实验确定USP9X结合HIF-1α抑制结构域（ID），TKTL1通过T-pyr结构域与HIF-1α和USP9X相互作用。在“TKTL1通过趋化因子CCL4招募PD-L1high DCs增强抗PD-1治疗敏感性”部分，scRNA-seq和CyTOF分析显示TKTL1敲低后DCs比例下降，PD-L1high DC（C37簇）表面PD-L1表达显著降低；临床PBMC CyTOF分析显示应答者治疗前常规DC（conventional DC, cDC）频率有升高趋势，治疗后应答者cDC水平增加而复发患者cDC频率降低；趋化因子阵列鉴定CCL4为TKTL1过表达细胞中最显著上调的DC相关趋化因子，ChIP证实HIF-1α直接结合CCL4启动子；CCL4抑制剂Maraviroc在体外阻断肿瘤上清对DC的趋化作用，在体内显著减弱TKTL1过表达背景下抗PD-1治疗的疗效。在“TKTL1介导的乳酸富集TME促进DCs中TRIM28K408乳酸化从而稳定PD-L1”部分，共培养实验和梯度乳酸处理显示乳酸浓度和时间依赖性上调DCs表面PD-L1表达；去乙酰化酶HDAC-1处理降低PD-L1表达和泛乳酸化水平；乳酸化蛋白质组学显示PD-L1本身不被直接乳酸化修饰，但免疫沉淀结合质谱分析鉴定TRIM28为PD-L1相互作用蛋白，其K408位点乳酸化在DCs中显著；K408位点突变降低TRIM28蛋白水平和PD-L1蛋白稳定性；Co-IP证实TRIM28与PD-L1相互作用，TRIM28通过增强SUMO化修饰抑制PD-L1蛋白酶体降解。在“通过仿生纳米系统靶向共递送Que和乳酸氧化酶协同抑制TKTL1和重塑HCC TME”部分，虚拟筛选鉴定天然化合物HY-N1968（Que）为TKTL1结合剂，分子对接显示其与TKTL1硫胺素二磷酸结合折叠结构域（pyr结构域）相互作用，分子动力学模拟证实复合物稳定性，微量热泳动测定结合亲和力Kd=27.53 μM；研究人员构建了空心介孔MnO?纳米颗粒共载Que和乳酸氧化酶（lactate oxidase, LOX）并包被HCC细胞膜（CQLH），该纳米系统具有pH响应性药物释放特性，在酸性条件下释放药物并促进Mn2?释放，体外功能验证显示有效降低乳酸水平并增加氧浓度，体内荧光成像显示强肝肿瘤特异性靶向和蓄积。
讨论部分指出，抗PD-1/PD-L1治疗在实体瘤中疗效有限，PD-L1作为生物标志物并不完美，在PD-L1低表达肿瘤中反应率仅约20%。研究人员将TKTL1鉴定为一种促进HCC进展但与抗PD-1治疗敏感性增强相关的癌蛋白，高TKTL1表达虽与未治疗HCC的不良预后相关，但似乎营造了一种免疫许可性TME，增加对PD-1阻断的易感性，使TKTL1成为兼具预后和免疫治疗反应预测价值的双重生物标志物。研究还讨论了TKTL1在多种恶性肿瘤中通过糖酵解重编程发挥作用的证据，并指出本研究揭示的TKTL1在常氧条件下通过招募USP9X绕过经典氧依赖性降解途径维持假缺氧状态的新机制。研究结论部分总结：TKTL1驱动的糖酵解不仅促进肿瘤细胞增殖和生存，还通过此前未描述的乳酸化依赖机制编排DC介导的免疫抑制；TKTL1被确立为ICI疗效的新型预测生物标志物和克服HCC免疫治疗耐药的有前景的治疗靶点；所开发的仿生纳米平台CQLH提供了一种同时靶向肿瘤代谢重编程和免疫抑制的合理联合策略，为HCC及潜在其他糖酵解依赖性癌症的精准免疫治疗开辟了新途径。该研究发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
