《Nature Communications》：Diminished sialoside binding in novel H5N1 influenza hemagglutinin variants identified in a human patient
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2024年，加拿大不列颠哥伦比亚省一名青少年女性因感染新型H5N1流感毒株（BC24）住院，出现包括呼吸衰竭在内的严重症状。研究人员使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术发现，在既往研究的H5血凝素（HA）蛋白唾液酸结合位点中发现的N169 α2,3-连接自
2024年，加拿大不列颠哥伦比亚省一名青少年女性因感染新型H5N1流感毒株（BC24）住院，出现包括呼吸衰竭在内的严重症状。研究人员使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术发现，在既往研究的H5血凝素（HA）蛋白唾液酸结合位点中发现的N169 α2,3-连接自身聚糖，在纯化的BC24 HA蛋白中缺失，这表明其对α2,3-连接唾液酸苷的亲和力显著降低。糖芯片（glycan microarray）和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析显示，BC24病例中鉴定出的HA变异体对α2,3-连接唾液酸苷和α2,6-连接唾液酸苷均表现出严重降低或完全缺失的结合能力。在A549肺泡癌细胞中表达的全长BC24 HA能够驱动膜融合，尽管融合水平低于既往的H5 HA蛋白；患者感染后血清与BC24 HA及其他流感亚型HA蛋白均表现出强结合能力。由于两个目标突变各自独立及联合作用时均能严重降低唾液酸苷结合能力，该病例中似乎存在多个受体结合表型减弱的病毒群体。BC24病例中弱结合HA变异体占据相当比例的少数群体，揭示了严重禽流感感染中可能存在的因素具有更多复杂性。
**研究背景与科学问题**
H5N1禽流感病毒在牛和鸟类中的暴发引起了对人畜共患传播的高度关注，确诊病例的病死率接近50%。2024年11月，加拿大不列颠哥伦比亚省一名青少年女性因感染新型H5N1流感毒株（A/British Columbia/PHL-2032/2024，简称BC24）住院，出现包括呼吸衰竭在内的严重症状。该毒株属于分支2.3.4.4b，由于未能从患者体内分离出完整病毒，研究人员通过对症状出现后第八天气管抽吸物（下呼吸道样本）进行测序，揭示了患者体内存在混合病毒群体。除聚合酶碱性蛋白2中已知的E627K突变外，该患者H5N1序列中观察到的最常见突变是血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白中的E190D和Q226H（以H3序列编号），各约占测序读数的三分之一。
HA是流感A病毒感染所必需的表面糖蛋白，负责结合宿主细胞受体并介导病毒与宿主内体膜的融合。HA的宿主受体通常为唾液酸苷：含α2,3-连接唾液酸（N-乙酰神经氨酸，N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）的受体常被视为禽类受体，含α2,6连接者常被视为人类受体。既往研究表明，E190D突变在H1 HA中与G225D协同可介导受体特异性向α2,6-连接唾液酸苷转换，但单独的E190D突变并未表现出促进唾液酸亲和力；HA第226位亮氨酸可赋予α2,6-连接唾液酸苷结合能力，但组氨酸在该位置未观察到类似效应。BC24病例中同时出现的E190D和Q226H突变是否导致HA受体特异性改变尚不清楚。为探究这些突变对HA结构和功能的影响，研究人员对BC24 HA以及两个参考毒株——分支1的A/Vietnam/1203/2004（VN04）和引起轻度人类疾病的分支2.3.4.4b A/Michigan/90/2024（MI24）——进行了系统研究。
**研究内容与主要结论**
该研究通过冷冻电子显微镜（cryogenic electron microscopy，cryo-EM）解析了三种H5 HA蛋白三聚体胞外域的前融合态结构，发现BC24 HA的唾液酸结合位点中缺乏此前在VN04和MI24 HA中观察到的N169位α2,3-连接自身聚糖密度，提示其对α2,3-连接唾液酸苷的亲和力严重降低。糖芯片分析证实BC24 HA对芯片上所有α2,3-和α2,6-连接唾液酸苷均无可检测的结合信号。ELISA突变分析表明E190D和Q226H突变各自独立及联合均可导致唾液酸苷结合能力严重降低。然而，全长BC24 HA在A549细胞中仍能驱动膜融合，尽管水平低于VN04和MI24 HA。患者血清对BC24和MI24 HA及其他流感亚型HA蛋白均表现出强抗体反应。该研究首次在严重人感染病例中鉴定出以相当比例存在的弱受体结合HA变异体，表明严重禽流感感染中可能存在比以往认识更为复杂的病毒适应机制。论文发表在《Nature Communications》。
**主要技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析HA三聚体胞外域的高分辨率结构；利用糖芯片（glycan microarray）技术系统评估HA蛋白对N-连接和O-连接聚糖的結合谱；利用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量检测HA突变体对代表性α2,3-和α2,6-连接唾液酸苷的结合能力；利用基于NanoBiT荧光素酶重组系统的细胞-细胞膜融合实验评估HA介导膜融合的功能；利用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）验证蛋白制品的均一性和稳定性；利用生物层干涉测量技术（biolayer interferometry，BLI）评估广谱中和抗体MEDI8852 Fab与HA的结合动力学。样本来源于加拿大不列颠哥伦比亚省儿童医院确诊的BC24患者及年龄匹配的健康对照者血清。
**研究结果**
**1. BC24 HA中N169 α2,3-连接自身聚糖密度缺失**
通过cryo-EM结构解析，VN04和MI24 HA蛋白的受体结合位点中均清晰观察到此前报道的N169自身聚糖密度，该聚糖被建模为GlcNAc-GlcNAc-Man-Man-GlcNAc-Gal-Sia，末端糖苷键为α2,3构型。然而，携带E190D和Q226H突变的BC24 HA的受体结合位点中未观察到该自身聚糖密度。由于三种HA蛋白的受体结合位点残基构象高度相似（RMSD值均小于0.45 ?），且BC24和MI24使用相同表达系统、序列相似性高，排除糖基化缺失的可能性，该结果表明BC24 HA对α2,3-连接唾液酸苷的亲和力降低是突变导致的特异性相互作用丧失所致。
**2. BC24与其他H5 HA蛋白糖基化模式比较**
在N21、N33、N158（仅VN04）、N169、N289和N483位点均观察到N-连接糖基化密度。N169位点仅在VN04和MI24 HA中解析出超出初始部分的密度，与这些聚糖结合在受体结合位点一致。N21和N158位点可见连接糖基的密度，但糖基本身可能无序而无法可靠建模。N158位糖基化此前被报道可中等程度遮蔽受体结合位点影响嗜性，而分支2.3.4.4b HA序列缺乏该糖基化位点，可能有助于人类感染性。
**3. BC24 HA缺乏结合α2,3-连接自身聚糖的结构解释**
受体结合位点残基的结构比对（残基98、133-140、153-156、183、187-195、220-228）显示三种HA蛋白间RMSD仅为0.378-0.448 ?。在VN04和MI24 HA中，E190羧酸根分别与Sia-1的C9羟基形成2.9和2.8 ?的氢键，Q226酰胺分别与Gal-2的C4羟基相距3.3和3.2 ?。而BC24 HA中，D190羧酸根与MI24结合态Sia-1对应位置相距4.9 ?，H226侧链偏离Gal-2 C4羟基位置1.1 ?。这些关键残基的变化为α2,3-连接自身聚糖缺乏结合提供了结构基础。
**4. 糖芯片分析显示BC24 HA不结合唾液酸苷**
在N-连接和O-连接聚糖芯片上，VN04和MI24 HA专一性结合α2,3-连接唾液酸苷，MI24 HA对唾液酸路易斯X（sialyl LewisX，SLeX）表现出轻度偏好，与既往报道一致。BC24 HA在检测灵敏度范围内对所有α2,3-连接唾液酸苷、α2,6-连接唾液酸苷及其他芯片糖均无结合信号。DLS结果显示所有蛋白制品稳定性相当，排除蛋白降解或聚集导致的假阴性。
**5. E190D和Q226H突变体ELISA糖结合评估**
在MI24背景下引入E190D和Q226H突变（正向突变）以及在BC24背景下引入D190E和H226Q回复突变，构建了所有可能的单突变和双突变组合。ELISA结果显示，携带D190或H226的任何突变体均对α2,3-和α2,6-连接唾液酸苷无可检测的结合，而回复突变D190E+H226Q恢复了BC24 HA对α2,3-连接唾液酸苷的结合能力。该结果表明E190D和Q226H各自均可独立导致唾液酸苷结合能力严重降低。
**6. BC24 HA具有膜融合能力**
在A549人肺泡上皮癌细胞中转染表达全长HA蛋白，通过短暂降低胞外 pH 模拟内体酸性环境触发HA介导的细胞-细胞融合。荧光显微镜观察到所有HA转染组均出现合胞体，NanoBiT荧光素酶定量显示BC24 HA介导的融合信号为VN04 HA的0.32倍，MI24为1.3倍，均显著高于模拟转染对照。BC24 HA介导的融合水平高于已知严重降低受体结合的Y98F突变体（0.11倍），说明弱结合变异体仍具有功能活性。
**7. MEDI8852对BC24 HA的中和效果**
在融合实验中加入广谱中和抗体MEDI8852 Fab的稀释系列，计算IC50值显示BC24 HA被MEDI8852有效中和（IC50值不劣于VN04和MI24）。BLI实验验证了MEDI8852 Fab与三种HA蛋白均存在纳摩尔级的特异性结合。
**8. BC24患者体液免疫反应**
对BC24患者四个时间点（血清Flu A RT-PCR转阴后1-4天）及四名年龄匹配健康对照者的血清进行ELISA检测。健康对照者对BC24和MI24 HA表现出中等反应性，推测为疫苗接种或季节性流感感染产生的交叉反应抗体。BC24患者血清对BC24和MI24 HA均表现出强反应性，且对H1、H2和H3 HA蛋白均表现出明显高于健康对照的交叉反应性，包括对非循环的H2N2毒株HA的高稀释度阳性信号，说明患者对感染产生了强效体液免疫应答，但仍未能防止严重疾病的发生。
**讨论与结论**
该研究的结构、生化和细胞实验一致证明BC24 HA对α2,3-连接唾液酸苷的亲和力严重降低。cryo-EM结构显示BC24 HA缺乏与N169自身聚糖的结合；糖芯片和ELISA证实其既不结合α2,3-也不结合α2,6-连接唾液酸苷；突变实验表明E190D和Q226H各自独立即可导致该表型。值得注意的是，BC24 HA仍保留膜融合能力且融合水平高于Y98F严重降低受体结合突变体，提示弱结合变异体在患者体内仍具有功能适应性。该案例不支持此前提出的E190D和Q226H突变可能使HA受体特异性从α2,3-向α2,6-连接唾液酸苷转换的假说。
研究人员提出，弱受体结合表型可能有利于病毒逃避上呼吸道受体而富集于下呼吸道远端，与BC24病例中下呼吸道病毒载量较高和病程较重的临床表现相符。然而，该病例未发生人传人传播，与α2,6-连接唾液酸苷结合促进人际传播的普遍认知一致。患者血清中检测到对H5 HA的强烈抗体反应和广泛的亚型交叉反应性，且HA仍可被广谱中和抗体MEDI8852有效中和，病毒对常规抗流感药物保持敏感，这些发现缓解了近期公共卫生紧急事件的担忧，但也提示严重禽流感感染中病毒适应机制可能比以往认识的更为复杂。受体结合强度并非人感染致病性的唯一决定因素这一观察，对流感大流行风险评估和人畜共患监测策略具有重要意义。
