《Leukemia》：Exploiting an epigenetic resistance mechanism to PI3-kinase inhibition in leukemic stem cells
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获得性非遗传耐药机制（acquired non-genetic resistance mechanisms）是导致急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）患者预后不良的重要因素，而无法靶向白血病干细胞（leukemic stem
获得性非遗传耐药机制（acquired non-genetic resistance mechanisms）是导致急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）患者预后不良的重要因素，而无法靶向白血病干细胞（leukemic stem cells, LSCs）可导致疾病复发。为克服这些挑战，研究人员测试了LSCs是否对磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）存在依赖性。研究人员发现，LSCs对PI3K的异构体选择性靶向敏感，尤其依赖PI3K的p110α异构体。研究人员发现，PI3K失活导致白血病细胞中EZH2/PRC2功能发生动态变化，并揭示EZH2蛋白水平下调是响应PI3K抑制的适应性耐药机制。研究人员还发现，AML细胞中PI3K抑制可导致EZH1代偿性上调，而EZH1敲低可增敏AML细胞对PI3K抑制的反应。研究人员利用这一耐药机制，将PI3K抑制剂与EZH1/2双重抑制剂联合使用，成功克服获得性耐药，并在离体（ex vivo）及小鼠AML和PDX模型体内（in vivo）实现持续靶向AML细胞。本研究确定了一种有前景的新型治疗方案，用于靶向AML中的LSCs。
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种预后极差的恶性血液肿瘤，近十年来患者生存改善有限，主要原因是现有治疗毒性大、缓解后复发率仍高达50%–70%。目前多数治疗针对快速增殖的白血病母细胞，但无法清除白血病干细胞（leukemic stem cells, LSCs），后者是导致可测量残留病（measurable residual disease, MRD）、复发和不良结局的关键。AML具有高度分子异质性，常见驱动突变涉及FLT3、KIT或RAS家族等激活信号分子，而PI3K/AKT通路作为其下游信号，在包括LSCs在内的高达80%的AML病例中被激活，因此成为有吸引力的治疗靶点。然而，PI3K抑制剂单药临床试验未能获批用于AML，可能与疗效不足、毒性以及尚未阐明的适应性耐药机制有关。本研究旨在探究LSCs对PI3K亚型的选择性依赖，并揭示PI3K抑制后非遗传耐药的表观遗传机制，进而据此设计联合治疗策略。
研究人员利用条件基因敲除小鼠和药理学抑制剂，发现AML LSCs对PI3K催化亚基p110α存在选择性依赖；PI3K抑制可诱导白血病细胞分化并丧失自我更新能力，但同时触发适应性非遗传耐药，表现为EZH2蛋白水平下调并代偿性依赖EZH1维持PRC2功能。研究人员将PI3K抑制剂copanlisib与EZH1/2双重抑制剂valemetostat联合使用，成功克服该获得性耐药，在体外、小鼠AML模型及患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）模型中持续清除功能性LSCs。该研究确定了联合靶向PI3K与EZH1/2的潜在治疗策略，为AML患者降低复发风险提供了新方向。
关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下方法：利用Pik3ca、Pik3cb、Pik3cd条件敲除或组合敲除小鼠模型，通过逆转录病毒转导KMT2A::MLLT3融合基因构建AML模型；以集落形成单位（colony forming unit, CFU）连续重铺实验评估LSC自我更新能力；采用基因表达微阵列与基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）比较转录组变化；应用组蛋白修饰蛋白质组学检测H3K27me3和H3K27ac改变；通过Western blot、实时定量PCR（qPCR）、流式细胞术等检测蛋白表达和分化标志；在体内采用二次移植极限稀释分析（extreme limiting dilution analysis, ELDA）计算白血病起始细胞频率；并使用PDX模型验证疗效。样本队列包括健康供体CD34+骨髓细胞、7例AML/高风险骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes, MDS）患者标本（涵盖复杂核型、TP53突变及维奈克拉耐药等难治亚型）以及多种基因型小鼠AML模型。
研究结果分述如下：
1. PI3K inactivation impairs leukemic stem cell self-renewal and promotes myeloid differentiation
通过条件敲除实验发现，急性缺失Pik3ca或Pik3cb显著降低KMT2A::MLLT3转化LSCs的连续重铺能力，而Pik3cd缺失仅减少初始集落。药理学抑制p110α（alpelisib）、p110δ（idelalisib）、p110α/δ（copanlisib）或泛PI3K抑制剂（buparlisib）均显著损害LSC自我更新，并诱导集落细胞出现单核/中性粒细胞形态分化；copanlisib处理人AML细胞系MOLM14、NOMO1和OCI-AML3后，单核细胞标志CD11b和CD15表达升高。结论：PI3K抑制可抑制LSC自我更新并促进髓系分化。
2. PI3K deletion depletes functional leukemic stem cells in vivo
在KMT2A::MLLT3-GFP移植模型中，Pik3cb缺失对白血病进展、生存和LIC频率无显著影响；而Pik3ca缺失显著延长原代移植受体生存，第45天骨髓中免疫表型LSCs减少，第60天单核标志CD115表达升高；二次移植极限稀释分析显示每个移植剂量下受体生存均延长，提示功能性白血病起始细胞（leukemia-initiating cells, LICs）被耗竭。结论：PI3Kα是体内LSC维持和白血病传播的关键调节因子。
3. Adaptive EZH2 regulation contributes to resistance following PI3K inhibition
对移植小鼠临床前骨髓中分选的GFP+粒细胞-巨噬细胞祖细胞（granulocyte-macrophage progenitors, GMPs）进行转录组分析，GSEA显示Pik3ca缺失的pre-LSCs中AKT信号下调、HOXA9敲低特征富集，并富集KAMMINGA_EZH2靶基因特征，提示PRC2转录程序改变。尽管Pik3ca缺失延缓疾病，但小鼠最终仍发生白血病；耐药白血病细胞中pAKT完全缺失，但EZH2蛋白显著降低，H3K27me3仍可检测。NOMO1细胞暴露于copanlisib后，EZH2蛋白在24小时内不变，随后逐渐下降。组蛋白蛋白质组学显示长期copanlisib处理增加H3K27me3丰度并降低H3K27ac丰度。结论：EZH2表达下降而PRC2活性维持的表观遗传重塑是PI3K抑制后非遗传耐药的机制。
4. PI3K inhibition creates an acquired dependence on EZH1
在copanlisib处理的NOMO1和MOLM14细胞中，EZH1 mRNA随时间呈上调趋势，MOLM14细胞中EZH1蛋白在48小时处理后持续表达。稳定敲低EZH1在基础条件下对增殖影响很小，但显著且剂量依赖性地增加细胞对copanlisib的敏感性。结论：PI3K抑制诱导白血病细胞产生对EZH1的条件性依赖。
5. PI3K inhibition cooperates with EZH1/2 dual inhibition to target leukemic cells
在多种KMT2A重排和非KMT2A重排AML细胞系中，copanlisib单药先抑制增殖，约一周后出现再生长；联合valemetostat则持续抑制增殖。HEL细胞对联合治疗不敏感，提示该组合并非非特异性细胞毒。流式分析显示联合治疗未进一步增加髓系分化，但显著增加G0期细胞周期阻滞，并在长期处理后增加凋亡。结论：PI3K与EZH1/2抑制协同主要通过诱导细胞周期阻滞和凋亡发挥抗白血病作用。
6. The PI3K inhibitor copanlisib cooperates with the EZH1/2 dual inhibitor valemetostat to target LSCs in vivo
在Npm1LSL-CA/+;NrasLSL-G12D AML移植模型中，联合治疗组生存期显著优于溶剂组或valemetostat单药组，且一半联合组小鼠存活至实验结束。脾细胞连续重铺实验显示联合组小鼠来源的集落重铺能力降低，并出现髓系分化形态。在KMT2A::MLLT3模型中，联合治疗组二次移植后受体生存延长，ELDA显示LIC频率显著降低约10倍。联合治疗对健康小鼠骨髓CFU总数有统计学降低，但所有髓系集落亚型仍存在，提示存在治疗窗口。结论：联合治疗在体内有效靶向功能性LSCs。
7. The copanlisib and valemetostat combination reduces colony formation in AML and MDS patient samples
在7例原代AML/高风险MDS患者标本的CFU实验中，联合治疗显著减少集落形成，部分标本对低至10–100 nM的valemetostat敏感，且在复杂核型、TP53突变和维奈克拉耐药样本中均观察到活性。在维奈克拉耐药患者标本来源的PDX模型中，联合治疗显著延长生存，而单药无显著效果，且未观察到明显体重下降。健康供体CD34+细胞仅在最高药物浓度下出现轻度的集落总数减少，但所有髓系集落亚型仍存在。结论：联合方案对原代AML和MDS细胞有效，且对正常造血祖细胞影响有限。
讨论部分指出，LSCs对PI3Kα存在依赖，但单药PI3K抑制会因适应性耐药而疗效短暂，这解释了既往临床试验的有限效果。耐药机制涉及EZH2蛋白下调并依赖EZH1补偿维持PRC2活性，联合EZH1/2抑制剂可靶向这一获得性脆弱点。copanlisib和valemetostat已在其他肿瘤中获批或进入临床，毒性可接受，本研究在多个AML模型和健康细胞数据中支持该联合治疗存在治疗窗口。未来需进一步明确决定联合方案反应性的分子和细胞遗传学特征。研究结论：数据支持联合PI3K与EZH1/2抑制作为AML患者的一种有前景的治疗方案，尤其用于靶向LSCs，从而降低复发风险。
