《European Journal of Human Genetics》：Reanalysis of genomic data doubles the diagnostic yield for Welsh patients recruited to the UK 100,000 Genomes Project
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摘要专业翻译
十万基因组计划（100KGP）对罕见病和癌症患者进行了全基因组测序，以研究基因在疾病中的作用，并将基因组学整合到英国医疗体系中。为参与100KGP，威尔士基因组医学中心（由NHS全威尔士医学基因组学服务（AWMGS）、卡迪夫大学和Genomics
摘要专业翻译
十万基因组计划（100KGP）对罕见病和癌症患者进行了全基因组测序，以研究基因在疾病中的作用，并将基因组学整合到英国医疗体系中。为参与100KGP，威尔士基因组医学中心（由NHS全威尔士医学基因组学服务（AWMGS）、卡迪夫大学和Genomics England组成的合作机构）招募了来自154个家庭的438名个体，这些家庭此前已接受过基因组前遗传学检测但未获得诊断。大多数先证者（64%，98/154）具有神经或神经发育表型。基因组测序、变异 calling、基于基因的过滤和变异优先级排序由Genomics England执行。AWMGS负责变异的临床解读、验证和报告。初始诊断率为20.8%（32/154），另有11个家庭报告了意义不明确的变异（VUS）。大多数初始发现（83.7%，36/43）可通过临床外显子组测序检测到，该检测是当时威尔士的标准诊疗手段。研究人员使用更新的变异优先级排序工具、扩展的基因列表、重新表型分析和分离分析对100KGP威尔士数据进行再分析，已将诊断率提高至42.2%（65/154）（提升了103%）。RNA分析被用于阐明COQ4、ENPP1、GATAD2B、NCAPD2和THOC2中VUS的临床意义。这些发现证明了基因组测序、RNA分析和周期性再分析基因组数据的临床实用性。
论文解读文章
一、研究背景与问题
英国政府于2013年启动了十万基因组计划（100KGP），这是一项临床与科研相结合的混合型计划，旨在通过全基因组测序（WGS）研究罕见病和癌症的遗传基础，并将基因组医学整合到英国国家医疗服务体系（NHS）中。威尔士的医疗保健责任归属于威尔士政府，其NHS体系与英国其他地区相对独立。威尔士拥有单一医学遗传学服务机构——全威尔士医学基因组学服务（AWMGS），该机构设有经CPA认证的NHS遗传学实验室，具备样本制备、基因组分析、变异解读和报告的专业能力。
2016年，威尔士成立了基因组医学中心（GMC），由AWMGS、卡迪夫大学和Genomics England（GEL）合作组成，于2018年1月至10月期间为100KGP招募参与者。此前，威尔士的罕见病患者在入组前均已接受过基因组前遗传学检测但未获得诊断，这构成了开展全基因组测序研究的重要临床需求。研究旨在评估WGS在真实NHS临床环境中的诊断价值，并探索数据再分析对提升诊断率的贡献。
二、研究内容与主要结论
研究人员共招募了154个家庭的438名个体，其中先证者104人（67.5%）在入组时未满18岁，85人为男性（55%）。大多数先证者（98人，63.6%）属于神经和神经发育疾病类别，其中66人（占所有先证者的42.9%）患有智力障碍（ID）。94%的先证者与家庭成员共同入组，其中119个（77%）为父母-子女三人组（trio）。
初始分析阶段（2018/2019年），在32/154个家庭（20.8%）中发现了与表型一致的致病性或可能致病性变异，另有11个家庭（7.1%）报告了“热点”意义不明确的变异（VUS）。初始诊断率略低于100KGP试点报告的水平（25%），这可能反映了入组人群的差异——威尔士队列招募了更多儿童（67.5%对26%）、更高比例的ID先证者（42.9%对6%）以及更多的三人组家庭（77%对36.5%）。
在随后7年中，研究人员通过多种途径持续进行数据再分析，包括新文献和新疾病基因的发现（n=12）、表型导向的变异审查（n=7）、结构变异（SV）检测（n=4）、改进的计算机剪接预测（n=3）、RNA分析（n=5）、已知易位断点分析（n=2）、改进的插入缺失（indel）calling（n=3）、临床变异数据库新增报告（n=2）、额外亲属检测（n=1）以及表观签名分析（n=1）。截至2025年，致病性或可能致病性变异已在65/154个家庭（42.2%）中被发现，较初始诊断率提升了103%。仍有78个家庭（50.6%）尚未确定遗传病因。
三、关键技术与方法
研究人员使用了多项关键技术方法。基因组测序方面，DNA由AWMGS实验室从血液中提取，送至GEL生物样本库，在Illumina测序平台上进行短读长全基因组测序，双端150bp读长比对至GRCh38参考基因组。变异 calling和分析采用GEL临床生物信息学流水线，基于PanelApp的“绿色”基因列表进行panel-based基因分析，小变异按频率、分离情况和遗传模式进行过滤并分为三个层级（Tier）。拷贝数变异（CNV）calling使用Canvas软件，结构变异检测使用Manta软件。变异解读遵循美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）和英国ACGS 2018指南。RNA分析方面，针对不同基因采用了靶向PCR结合Sanger测序或全转录组RNA-seq方法。此外，研究人员还使用了更新的变异优先级排序工具、扩展的基因列表、重新表型分析、分离分析以及AbSplice评分等现代分析工具。样本队列来源为2018年1月至10月期间由AWMGS临床遗传学家或学术眼科医生转诊的威尔士罕见病患者家庭。
四、研究结果
先证者人口统计学特征：共招募154名先证者和284名家庭成员。大多数先证者（63.6%）属于神经和神经发育疾病类别，42.9%患有智力障碍。15名先证者（9.7%）在多个疾病类别下入组。145名（94%）先证者与家庭成员共同入组，以父母-子女三人组为主（77%）。
变异评估：92/154个家庭（59.7%）发现了一个或多个Tier 1和/或Tier 2变异（SNV和indel）；所有其他家庭均返回了三个或更多Tier 3变异（平均每家庭81.4个）。Tiered CNV仅返回给45/154个家庭（29.2%），平均每家庭报告1.2个Tier A（高优先级）和67.2个Tier Null（低优先级）CNV。22个变异在正式多学科团队（MDT）会议中讨论（20个被报告），27个其他变异通过实验室科学家与临床医生之间的电子邮件讨论（23个随后被报告）。与苏格兰100KGP报告一致，返回解读的tiered变异数量随家庭规模增大而减少。
诊断率：初始分析在32/154个家庭（20.8%）中发现致病性或可能致病性变异，11个家庭（7.1%）有“热点”VUS返回。初始发现包括4个Tier A CNV，其余为小变异。83.7%（36/43）的报告发现位于TSO panel的靶向区域内。经过7年的持续再分析，截至2025年，致病性或可能致病性变异已在65/154个家庭（42.2%）中被发现，诊断率提升103%。
次要发现：422名选择接收健康相关额外发现的参与者中，7人（1.7%）返回了次要发现。返回的致病性变异位于BRCA2、MSH6和RET基因中。两名个体携带LDLR变异，被分类为“冷”VUS而未返回。该比率与100KGP其他地区罕见病先证者（1.58%）和亲属（1.7%）的额外发现返回率相似。
持续审查与再分析：研究人员使用AWMGS开发的现代诊断流水线系统性地再分析了100KGP威尔士数据，包括审查VCF文件中的SNV、CNV和短串联重复序列（STR）。每名先证者平均识别出58个变异供进一步评估。在可获取VCF文件的144个家庭中，70个有既往报告的变异，其中60/70（85.7%）被现代诊断流水线检测到。现代流水线与初始分析的关键差异包括访问ClinVar等当代变异数据库（n=12个新变异）、SpliceAI注释（n=4）以及Manta/Canvas数据的使用（n=2）。有4个诊断性变异因低质量指标或读深度被过滤，2个变异因从标记为未受影响的父母遗传而被过滤，1个变异为嵌合体（SCN2A，等位基因分数18.8%），1个变异因gnomAD频率被过滤（TUBB2A，位于高同源区域）。ENPP1中的纯合SV和t(6;13)易位未在GEL提供的SV VCF中检测到。
RNA分析：RNA分析被用于阐明COQ4（个体P1）、NCAPD2（个体P2）、GATAD2B（个体P3）、THOC2和ENPP1中变异的临床意义。P1是一名16岁男性，患有早发性难治性癫痫、严重发育迟缓、肌张力障碍、乳酸酸中毒和肌肉呼吸链酶研究异常，但肌肉CoQ10水平正常。RNA-seq数据显示COQ4 RNA显著降低（倍数变化0.69，z=?7.46，校正P=5.72×10?7），且截短异构体比例升高（25%对对照约1%）。两个COQ4变异均被分类为可能致病性。P2是一名14岁男性，患有先天性小头畸形（?8 SD）、中度ID、身材矮小、双侧听力损失和既往原始神经外胚层肿瘤。NCAPD2中的两个变异经靶向RNA分析证实均产生异常转录本，均被分类为可能致病性。P3是一名16岁女性，患有全面发育迟缓、ID、肌张力减退和失神发作。GATAD2B变异通过AbSplice评分分析检测到，为de novo变异，预测在内含子6中创建假外显子，靶向RNA分析证实了含有假外显子的异常转录本的存在，该变异被分类为可能致病性。
五、讨论与结论
研究人员发现，现代NHS WGS分析流水线能够检测到研究界使用100KGP威尔士数据识别出的85.7%的诊断性变异。NHS流水线遗漏诊断性变异的主要原因是变异从标记为未受影响的父母遗传，以及VCF文件中变异的质量或读深度问题。VCF文件生成于2018年，原始未处理数据文件（如FASTQ文件）不可用。遗传自被认为未受影响的父母的显性遗传等位基因仍然是解读的挑战。
100KGP威尔士队列的再分析结果与越来越多的证据一致，即对未解决病例的基因组数据进行周期性再分析可以显著提高罕见病队列的诊断率。多项研究报告的再分析诊断率提升范围为2.3%至22%，Dai等人的荟萃分析显示再分析的总体诊断率为10%。临床遗传学家参与数据解读已被证明可带来15.5%的诊断率提升。在100KGP威尔士队列中，表型评估和临床见解促成了多个tiered变异的升级分类（2025年新报告变异或升级VUS中7/36，占19%）。
研究人员承认该研究的局限性：100KGP威尔士队列规模相对较小（154个家庭），可能限制研究结果的普适性；研究未确定再分析的最佳频率或在资源有限的医疗环境中的成本效益。实施系统性再分析面临若干挑战，包括劳动力能力、伦理、法律和经济方面的考量。RNA分析在调查被分类为VUS的tiered变异方面特别有用，RNA测序对确立P1的COQ4相关CoQ10缺乏症诊断至关重要。
研究结论：研究结果证明，基因组测序结合系统性再分析可显著提高罕见病的诊断率。七年间诊断率提升103%凸显了基因组诊断的动态特性，以及医疗体系需要实施基因组数据周期性再分析方案的必要性。研究结果证明了将RNA-seq和改进的SV检测等新技术整合到常规基因组诊断中的价值，同时强调了将基因组研究嵌入常规临床护理、促进新发现并提高患者诊断率的重要性。
