梯度乙醇沉淀（GEP）分级桑黄（Sanghuangporus vaninii）多糖：理化性质与肿瘤细胞增殖抑制

《Foods》：Gradient Ethanol Precipitation of Sanghuangporus vaninii Polysaccharides: Physicochemical Properties and Inhibition of Tumor Cell Proliferation

　　

为探究分子量对桑黄（Sanghuangporus vaninii）多糖结构、理化性质及肿瘤细胞增殖抑制的影响，研究人员通过梯度乙醇沉淀法从桑黄子实体中依次分离得到3个多糖组分（SH-40、SH-60和SH-80）。结果表明，这3个组分的分子量分别约为5.90 × 10⁵、4.82 × 10⁵和4.13 × 10⁵ Da；它们具有相似的官能团特征、单糖组成和糖苷键。随着分子量降低，持水性（water holding capacity，WHC）下降，而水溶性指数（water solubility index，WSI）和持油性（oil holding capacity，OHC）升高。在肿瘤细胞增殖抑制试验中，3个组分均以浓度依赖方式抑制MCF-7、HepG2、A549和SGC-7901细胞增殖，并在正常人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中维持较高的细胞存活率（>70%）；其中，SH-40的半最大抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀）值最低（1.09–3.89 mg/mL）（p < 0.05）。由于SH-40具有较高分子量和特征性单糖比例，其生物活性最高（p < 0.05），提示分子量是影响其功能和活性的重要因素之一。这些发现为桑黄多糖的分级制备和差异化应用提供了依据。

研究背景方面，桑黄（Sanghuangporus vaninii），又名Phellinus vaninii，属于担子菌门、伞菌纲、锈革孔菌目、锈革孔菌科。在中国，桑黄具有悠久的药用和食用历史，民间常以其子实体水煎煮制备日常保健饮品。传统中医实践中，该真菌常用于治疗腹泻、子宫出血、闭经和胃肠功能障碍。其良好的水溶性使桑黄多糖成为水煎液的主要成分，现代药理研究证实，这些多糖正是桑黄水提物发挥抗肿瘤、抗氧化和保肝等多种生物活性的关键活性物质。已有研究表明，不同真菌多糖因分子量差异而表现出不同生物活性。Dai et al. 通过分级醇沉从蛹虫草中获得6个多糖组分，发现低分子量组分LMW-CMP（3.06 × 10³ Da）通过MAPK/NF-κB通路对HepG2细胞增殖抑制最强。Hsiao et al. 通过梯度乙醇沉淀从Pleurotus ostreatus中分离POP-40、POP-60和POP-80，发现高分子量组分POP-80（6.71 × 10⁵ Da）对UVA诱导的Hs68细胞光老化效果最好。上述研究提示，分子量可能是影响真菌多糖活性的关键结构因素之一。然而，关于不同分子量桑黄多糖的结构、功能和生物活性仍鲜有报道。

目前存在的问题是，分离不同分子量多糖常用的柱层析、膜过滤等方法成本高、耗时长，限制了其在食品工业中的应用。梯度乙醇沉淀（gradient ethanol precipitation，GEP）利用多糖在不同乙醇浓度下溶解度差异，按分子量逐步分离，操作简便、成本较低、条件温和且易于放大，已成功应用于蛹虫草、Pleurotus ostreatus和Pholiota nameko等真菌多糖分离。因此，利用GEP从桑黄中获得不同分子量多糖组分，并系统比较其功能和生物活性差异，对功能食品或药物研发中的精准应用具有重要意义。癌症已成为全球第二大死因，传统抗癌药物常有毒副作用且不适合长期使用，寻找高安全性、适合长期膳食干预的辅助生物活性化合物成为食品科学的重要方向。食用真菌多糖因生物相容性好、药理活性多样、低毒且可口服，在癌症辅助治疗功能食品开发中具有独特优势。桑黄多糖的抗肿瘤活性已在肝癌、肺癌、乳腺癌和胃癌等细胞系中报道，但多数研究集中于粗提物或特定分离组分，仍缺乏不同分子量桑黄多糖组分对多种肿瘤细胞抑制作用的交叉比较研究。

基于此，研究人员以桑黄子实体多糖为对象，采用GEP（40%、60%、80%）对粗多糖混合物进行简化分级，获得不同分子量范围的多糖组分，并通过系统表征和HepG2、MCF-7等肿瘤细胞系体外抑制肿瘤细胞增殖筛选，阐明不同多糖组分的理化性质与肿瘤细胞增殖抑制差异，为桑黄多糖精准分级制备及其在功能食品和药物中的差异化应用提供科学依据。研究人员得出，随乙醇沉淀浓度升高，多糖分子量依次降低；单糖组成和糖苷键类型总体一致，但单糖摩尔比、功能活性和体外抑制肿瘤细胞增殖效果存在明显差异。该研究说明GEP不仅是高效粗分级技术，也可作为基于功能活性差异进行选择性富集的分级纯化方法，具有工艺和经济上的潜在意义。

研究人员为开展研究采用的主要关键技术方法包括：样本为购自中国吉林省和龙市八家子镇的桑黄干燥子实体；采用热水提取、40%/60%/80%梯度乙醇沉淀和Sevag法脱蛋白制备SH-40、SH-60、SH-80；采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FT-IR）和比旋光度测定官能团与旋光性；采用高效凝胶渗透色谱（high-performance gel permeation chromatography，HPGPC）测定分子量和均一性；采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolidone，PMP）柱前衍生化HPLC测定单糖组成；采用甲基化结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析糖苷键；采用刚果红实验、热重（thermogravimetric，TG）分析、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）分析构象、热稳定性和表面形态；测定水溶性指数（WSI）、持水性（WHC）和持油性（OHC）；采用CCK-8法检测MCF-7、HepG2、A549、SGC-7901和HUVEC细胞活力，并计算IC₅₀；统计采用SPSS和GraphPad Prism。

研究结果如下。3.1 理化性质测定：通过制备和化学组成测定发现，乙醇浓度由40%升至80%时，粗多糖得率、总糖含量和蛋白质含量相应增加；纯化后SH-40、SH-60、SH-80总糖均大于82%，SH-80总糖和糖醛酸含量显著高于其他两组（p < 0.05），且未检出蛋白质。说明GEP不仅可分离不同分子量多糖，还导致化学组成系统变化，高乙醇浓度沉淀组分多糖纯度较高、蛋白杂质较低。

3.2 FT-IR与比旋光度：通过FT-IR和旋光测定，三种多糖在3400、2920、1620、1400、1200–1000、890和805 cm^?1附近具有典型多糖吸收，分别对应O-H、C-H、C=O、C-H、吡喃环C-O-C/C-O-H/O-C-O及β-/α-糖苷键。三者峰位基本一致，但部分谱带强度不同；比旋光度[α]_D²⁰分别为+3.03°、?2.40°和?6.00°，随乙醇浓度增加由正变负且负值增大。说明三者初级官能团相似，但乙醇浓度可能影响不同极性、分子量和聚集状态组分的沉淀，改变官能团含量和分子间氢键。

3.3 分子量与均一性：HPGPC测定显示，三种多糖均为单一对称峰，多分散指数为1.1–1.2，表明均一性较好；M_w分别为5.90 × 10⁵、4.82 × 10⁵和4.13 × 10⁵ Da。乙醇浓度增加使保留时间延长，间接反映分子量降低，与Dai et al.、Hsiao et al.和Zhang et al.的GEP趋势一致。原因可能是乙醇浓度增加降低混合溶剂极性，破坏多糖水化层，降低溶解度，使高分子量多糖优先在低乙醇浓度沉淀，低分子量多糖需更高乙醇浓度沉淀。

3.4 单糖组成：HPLC检测到4种中性糖（Man、Rha、Glc、Gal）、2种糖醛酸（GlcA、GalA）和1种氨基糖（GlcN）。三者均主要由Man、Glc和Gal组成，但摩尔比不同，均为杂多糖，其中Glc最高、Rha最低。随乙醇浓度升高，Glc和GlcA含量增加，Gal和GalA呈相反趋势。类似选择性醇沉现象也见于Wang et al.关于Lentinus edodes基质多糖和Hsiao et al.关于Pleurotus ostreatus多糖的研究。说明乙醇不改变单糖种类，而是通过组分间相互作用差异实现分级。

3.5 甲基化分析：通过GC-MS分析部分甲基化糖醇乙酸酯，参考CCSD/CCRC数据库，发现三种多糖糖苷键组成相同，仅相对丰度有差异。主要残基包括Glc、Gal、Man和GlcN；Glcp连接方式最丰富，有1,6-Glcp、1,2-Glcp和1,3-Glcp；Manp为1,4-Manp和1,3-Manp；Galp仅为1,3-Galp；GlcpN为1,3-GlcpN。说明GEP主要基于分子量差异分级，不改变糖苷键类型。

3.6 刚果红实验：SH-60和SH-80与刚果红反应后，λ_max随NaOH浓度增加明显红移，提示可能形成三螺旋构象；即使NaOH浓度达1.0 mol/L，红移仍稳定，说明复合物较稳定。SH-40相比对照组无特征红移。说明SH-60和SH-80可能具有三螺旋构象，SH-40未表现该特征。

3.7 热重分析：TG和微分热重分析显示，SH-40和SH-60为两阶段失重，SH-80为三阶段失重，说明SH-80热降解过程更复杂。第一阶段30–199.1 °C失重10.03%–10.90%，归因自由水和结合水蒸发。SH-80第三阶段269.1–799.3 °C失重48.26%，可能与残余碳质物进一步分解有关。主降解阶段可能与糖苷键断裂有关；DTG峰温分别为SH-40 318.4 °C、SH-60 322.2 °C、SH-80 316.0 °C，SH-60主链耐热性较强，SH-80降解温度最低。799.3 °C残余质量比以SH-40最高、SH-80次之、SH-60最低。说明三者热稳定性存在差异。

3.8 SEM分析：SH-40在低倍下为不规则块状聚集体，结构致密，高倍下表面多孔但整体完整，紧密堆积形态与高分子量相关。SH-60为疏松多孔网络结构，粒径较小，表面有细小微孔，可能与中等分子量有关。SH-80主要为大小不一的不规则块状颗粒，分散性差，表面粗糙，粒径分布较集中，与其低分子量一致。说明表面形态与分子量相关。

3.9 WSI、WHC和OHC测定：随醇沉浓度升高，SH-40、SH-60、SH-80的WSI分别为0.86 ± 0.11、0.94 ± 0.17和0.95 ± 0.13 g/g；WHC分别为2.71 ± 0.20、0.99 ± 0.26和0.56 ± 0.11 g/g；OHC分别为3.29 ± 0.16、3.63 ± 0.19和5.82 ± 0.21 g/g。WSI与结构和分子量相关，SH-40致密块状使水难渗透而WSI最低，SH-60多孔网络增加接触面积使WSI居中，SH-80低分子量易分散使WSI最高。WHC不只由分子量决定，还受溶解性和聚集状态共同调节；SH-40依赖物理网络保水，离心下截留水易去除，但测得WHC反而较高；SH-60和SH-80亲水性强但WSI高导致部分溶解丢失，且缺乏大分子链缠结形成的三维框架，故WHC较低。OHC以SH-80最好，主要归因于其最低分子量形成细小碎片、增加比表面积和物理吸附位点，同时较高Glc含量和潜在三螺旋疏水区域增强油亲和与保留。

3.10 细胞活力测定：CCK-8实验显示，空白对照无显著差异（p > 0.05）。三种多糖对肿瘤细胞活力的抑制呈浓度依赖。0.05–2 mg/mL范围内，SH-40细胞毒性最强，尤其对MCF-7最明显（p < 0.05）。2 mg/mL时，SH-40对MCF-7抑制率为73.53 ± 3.68%，IC₅₀为1.09 mg/mL；对HepG2、A549和SGC-7901的IC₅₀分别为1.51、1.55和3.89 mg/mL。HUVEC中，同浓度范围内SH多糖毒性较低，细胞存活率均大于70%。研究人员未由IC₅₀计算选择性指数，仅基于细胞存活率评价正常细胞毒性，说明SH多糖对HUVEC仅弱抑制，但对肿瘤细胞的选择性仍需进一步实验确认。抑制效果可能与构效关系有关；SH-40抑制较强，其较高分子量提示分子量可能是影响因素之一，与高分子量Phellinus igniarius菌丝体多糖活性更强的报道一致。但分子量并非唯一决定因素，本研究中分子量、单糖组成和摩尔比、糖苷键类型、构象及理化性质同时变化，因此仅提示这些因素可能共同影响细胞增殖，尚不能建立因果构效关系。理化性质方面，SH-40分子量和WHC较高，WSI和OHC较低；SH-60和SH-80相反。细胞增殖抑制幅度大体与分子量和WHC变化趋势一致，与WSI和OHC变化趋势相反。较高WHC可能归因于较高分子量及链间缠结或聚集，有助于维持特定空间构象，从而影响与细胞相互作用；较高WSI和OHC主要反映低分子量组分优良水溶性和脂结合能力，主要影响食品加工行为，不等同于更强细胞增殖抑制活性。因此，WSI、WHC和OHC可影响食品体系中溶解和分散行为，但不能单独决定抑制细胞增殖。分子量是影响因素之一但非唯一。上述结果仅反映对细胞增殖的影响，不足以证明抗肿瘤活性或选择性；未来需分离均一多糖、阐明精细结构、开展机制实验、根据IC₅₀计算选择性指数并进行体内验证。

结论部分翻译如下：本研究采用梯度乙醇沉淀法（GEP）从桑黄（Sanghuangporus vaninii）子实体中分离出3个多糖组分（SH-40、SH-60和SH-80）。结果表明，随着乙醇沉淀浓度升高，各组分的分子量依次降低；尽管各组分间单糖组成和糖苷键连接模式大体一致，但其单糖摩尔比、功能活性以及体外抑制肿瘤细胞增殖效果存在明显差异。这些发现表明，GEP不仅是一种高效粗分级技术，也是一种能够根据功能活性差异进行选择性富集的分级纯化方法，可一步分离得到具有不同生物活性的特定多糖组分。从工艺工程角度看，以较低乙醇浓度开始沉淀的潜在优势在于，40%乙醇优先沉淀高分子量组分（SH-40），该组分也表现出最强的肿瘤细胞增殖抑制活性。这可能使研究人员在降低乙醇消耗和溶剂回收负担的同时获得高活性产品。然而，这一优势仅基于实验室规模分离结果；该方法在实际放大中的可行性和经济性仍需通过中试和工业规模实验进一步验证。尽管本研究表明SH多糖对肿瘤细胞增殖具有较强抑制作用，但其选择性指数、体内抗肿瘤活性和分子机制仍需进一步研究。