基于混合强阳离子交换磁性固相萃取（MCX-MSPE）联用HPLC-MS/MS的甘蔗及甘蔗汁中3-硝基丙酸（3-NPA）高效提取与测定

《Foods》：Effective Extraction and Determination of 3-Nitropropanoic Acid in Sugarcane Samples Based on Magnetic Solid-Phase Extraction Coupled with HPLC-MS/MS

　　

为降低与3-硝基丙酸（3-nitropropanoic acid, 3-NPA）污染相关的风险，研究人员建立了将磁性固相萃取（magnetic solid-phase extraction, MSPE）与高效液相色谱-串联质谱法（high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS）相结合的高效、准确的甘蔗样品中3-NPA测定分析方法。由于氢键和疏水相互作用，混合强阳离子交换（mixed strong cation exchange, MCX）磁性吸附剂对3-NPA表现出有效提取能力。MSPE过程仅消耗2 mL有机溶剂，操作时间短（5 min）。检测限（limit of detection, LOD）为甘蔗汁0.02 μg kg^?1、甘蔗0.04 μg kg^?1。所建立方法显示出令人满意的加标相对回收率（96.9–105.4%）和良好的精密度（相对标准偏差，relative standard deviation, RSD，1.4–9.7%）。MCX-MSPE净化部分缓解了基质抑制，绝对基质效应（absolute matrix effect, ME%）值从39.4%提高至57.1%。该研究为甘蔗样品中3-NPA的测定提供了高效分析替代方法。

研究背景与问题：3-硝基丙酸（3-nitropropanoic acid, 3-NPA）是由Arthrinium产生的神经毒素，常发现于霉变甘蔗、玉米和椰子及相关产品中。作为天然神经毒素，3-NPA可致人中毒，症状从呕吐、腹痛到肌张力障碍、昏迷甚至死亡。随着全球气候变化加剧，3-NPA污染事件在全球范围内明显增多。在塞尔维亚，炎热干燥气候下玉米中3-NPA污染水平达44%；在中国，霉变甘蔗中3-NPA已被确定为中毒病因。中国是主要甘蔗生产国，迫切需要有效监测3-NPA污染以保障食品安全和公共健康，但目前尚未建立3-NPA测定的标准化分析方法，严重限制了甘蔗中3-NPA污染的准确高效监测。现有分析方法包括荧光传感、电化学技术、气相色谱-大气压化学电离-串联质谱法（GC-APCI-MS/MS）和HPLC-MS/MS。荧光传感和电化学方法灵敏度高、响应快，但实际应用易受复杂食品基质干扰；GC-MS/MS需对3-NPA衍生化，费力、耗时且可能引入额外分析变异；HPLC-MS/MS无需衍生化、可直接分析。然而，3-NPA高极性、低分子量、亲水，计算辛醇-水分配系数（XlogP）为?0.5，在反相色谱柱上保留差，易与基质组分共洗脱；加之显著基质效应（主要为离子抑制）、天然含量低且无商业化同位素内标，仅靠仪器参数优化难以获得准确结果。因此，有效样品前处理和净化对稳健准确测定3-NPA至关重要。固相萃取（SPE）广泛用于前处理，但早期伯仲胺（PSA）和NH₂ SPE柱选择性有限，导致基质干扰和分析准确度下降；洗脱需氢氧化铵，碱性条件可诱导3-NPA降解，降低方法稳定性和重现性；传统SPE耗时30–60 min、劳动密集且依赖专用设备，限制高通量分析。近年来，MSPE因操作简单、快速、提取效率高和有机溶剂消耗低而受关注。迄今仅一篇报道用分子印迹聚合物MSPE预处理3-NPA，但分子印迹聚合物合成较复杂，实验室间标准化和重现性困难。商业磁性吸附剂稳定且应用潜力广，但尚未见用于3-NPA样品预处理。因此，研究人员建立MCX-MSPE-HPLC-MS/MS方法，系统优化提取条件和MSPE流程，评估商业磁性吸附剂在复杂甘蔗基质中的提取性能并阐明提取机制。研究结论：首次将MCX基MSPE与HPLC-MS/MS联用用于甘蔗和甘蔗汁中3-NPA高效提取和可靠测定；MCX磁性吸附剂通过氢键和疏水作用有效提取3-NPA并具有较强抗基质干扰能力；方法线性、精密度和准确度满意；与已有方法比，预处理时间更短、有机溶剂消耗更低、分析性能更好；为3-NPA痕量分析提供新策略，并为甘蔗及相关产品食品安全评估提供潜在技术支持。

关键技术方法：样本队列来源：空白甘蔗样品来自中国上海当地市场；17个实际甘蔗样品来自中国上海浦东新区当地市场。样品经4 mL乙腈（ACN）超声提取5 min，加1 g氯化钠（NaCl）涡旋离心，上清稀释、氮吹浓缩；MSPE以10 mg MCX为吸附剂，经甲醇和2%（v/v）甲酸水溶液活化，上样涡旋1 min磁分离，1 mL ACN涡旋洗脱1 min，过滤；采用HPLC-MS/MS，BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），40 °C，5 mM乙酸铵水溶液和甲醇梯度洗脱，流速0.3 mL min^?1，电喷雾电离（ESI）负离子模式，多反应监测（MRM）检测，前体离子m/z 117.9，特征碎片离子m/z 46.1。方法验证包括线性、LOD、定量限（LOQ）、准确度、精密度和基质效应。

研究结果：
3.1 溶剂提取程序优化：通过考察ACN体积、搅拌方式、超声时间和NaCl用量对提取率（EY）的影响，研究人员确定4 mL ACN为最佳提取溶剂体积。ACN从2 mL增至4 mL时EY升高，继续增至8 mL则下降；超声搅拌优于涡旋搅拌；超声时间5–25 min无显著差异，5 min被选用；NaCl从0.5 g增至1 g时EY由63.6%升至75.1%，继续增加变化不大，故选1 g NaCl。
3.2 MSPE程序优化：通过比较混合强阴离子交换（MAX）、MCX、PSA、亲水作用液相色谱（HILIC）、NH₂和亲水-亲脂平衡（HLB）六种磁性吸附剂，发现MAX吸附效率最高（99.9%），但洗脱回收率（ER）低于1%；MCX吸附45.7%、ER 70.8%，PSA吸附49.4%、ER 62.1%，HLB吸附仅4.9%。提取机制研究表明，3-NPA含羧基、硝基和短烷基链，XlogP ?0.5；MCX经2%（v/v）甲酸活化，吸附体系pH 2.4，此时3-NPA羧基主要质子化为中性分子，不与MCX表面磺酸基发生强静电吸引，而羧酸质子可作为氢键供体与磺酸基作用，聚苯乙烯骨架提供疏水作用；HLB与MCX骨架相同但无磺酸功能化，吸附仅4.9%，MCX为45.7%，表明氢键主导、疏水作用次要。PSA在中性条件通过阴离子交换吸附。甘蔗汁中MCX的ER为71.6%，约为PSA（9.0%）的8倍，显示MCX抗基质干扰能力较强。MCX用量从5 mg增至10 mg时ER由52.9%升至72.1%，继续增至25 mg趋于稳定，故选10 mg。洗脱剂考察显示ACN的ER最高（97.6%），MeOH为87.6%，加入NH₄OH后ER降低，且碱性条件下3-NPA约43 min几乎完全降解，因此选ACN为洗脱溶剂。
3.3 方法验证与基质效应评价：通过加标甘蔗和甘蔗汁样品验证方法，线性范围R²均为0.999；甘蔗汁和甘蔗中LOD分别为0.02和0.04 μg kg^?1，LOQ分别为0.1和0.12 μg kg^?1；三个加标水平相对回收率（RR）为96.9–105.4%，日内和日间RSD分别为1.4–9.7%和1.1–6.6%；在LOQ水平，RR为85.8–106.3%，RSD为10.5–17.8%。基质效应评价表明，MSPE净化前粗提物ME为39.4%，MCX-MSPE净化后升至57.06%，说明净化去除了部分干扰基质并减轻离子抑制。由于3-NPA仅获得单个特征碎片离子m/z 46.1，结构确证存在固有局限和假阳性风险；研究采用严格保留时间匹配和MCX-MSPE净化降低风险，未观察到共洗脱干扰峰，未来可疑干扰可用高分辨质谱（HRMS）验证。
3.4 与其他方法比较：通过比较已报道的农业基质中3-NPA测定方法，本方法仅消耗6 mL有机溶剂，低于已报道的11–56 mL；全样品预处理约50 min，少于多数需超过100 min的方法；检测限更低，相对回收率满意。
3.5 实际样品分析：研究人员将17个来自中国上海浦东新区的甘蔗样品分为根上10–40 cm段和中上段，分别用所建立方法分析，均未检出3-NPA；MRM色谱在3-NPA保留时间0.84 min处无目标峰和干扰物。代表性样品冷藏一周后未出现Arthrinium感染红点，3-NPA仍不可检出。限制在于缺乏自然污染阳性样品，且样本有限，不能完全反映商业甘蔗总体污染状况，未来需跨地域大规模监测。

讨论部分总结与结论翻译：讨论指出，MCX-MSPE可部分减轻基质抑制，但仍有中等基质效应，可通过基质匹配校准一定校正；单特征碎片离子定量带来确证限制，需保留时间匹配和净化，必要时HRMS验证；实际样品未检出且无自然污染阳性样品，方法在自然污染基质中的性能尚未证明。结论翻译：首次展示了基于MCX的MSPE与HPLC-MS/MS联用，用于甘蔗和甘蔗汁中3-NPA的高效提取和可靠测定。混合强阳离子交换反相MCX吸附剂通过氢键相互作用和疏水相互作用实现3-NPA有效提取。同时，甘蔗样品中基质干扰被部分缓解，吸附剂表面带负电磺酸基团的静电排斥被认为是观察到部分净化作用的贡献机制。在优化条件下，所建立方法成功用于甘蔗样品中3-NPA测定，并表现出令人满意的线性、精密度和准确度。与先前报道方法相比，所开发的MCX-MSPE技术具有更短样品预处理时间、更低有机溶剂消耗和更好分析性能。该工作为3-NPA痕量分析提供了新策略，并为甘蔗及相关产品食品安全评估提供潜在技术支持。