Lactiplantibacillus plantarum 固态发酵改变杜仲（Eucommia ulmoides）叶多糖理化特性并增强其抗氧化与免疫调节活性

《Foods》：Lactiplantibacillus plantarum Fermentation Alters the Physicochemical Characteristics and Enhances the Antioxidant and Immunomodulatory Activities of Eucommia ulmoides Leaf Polysaccharides

　　

杜仲叶多糖（EUPSs）是具有抗氧化和免疫调节潜力的植物源大分子。本研究探讨了使用 Lactiplantibacillus plantarum 固态发酵（solid-state fermentation）是否改变 EUPS 的理化特性（physicochemical characteristics）和生物活性（bioactivity）。研究人员比较未发酵和发酵多糖组分（分别为 EUPS 和 FEUPS）的得率、单糖组成（monosaccharide composition）、分子量（molecular weight）、红外特征（infrared characteristics）、形态（morphology）和自由基清除活性（radical-scavenging activity），并在环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）诱导的免疫抑制小鼠中进一步评价。发酵使干燥多糖组分的回收得率提高至19.45%，较未发酵提取物增加55.1%，并改变单糖组成和分子量分布，同时基本保留主要官能团。FEUPS 呈现更疏松、更多孔的形态，且对 DPPH^•、ABTS^•+ 和羟自由基（hydroxyl radical）的清除活性强于 EUPS。在体内（in vivo），FEUPS 改善体重增长、组织病理学特征（histopathological features）、血清免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）水平、肝脏抗氧化状态（hepatic antioxidant status）和脾脏基因表达谱（splenic gene-expression profiles）。与相应 EUPS 组相比，FEUPS 在所选免疫和抗氧化相关参数上显示显著差异，尤其在中剂量。FEUPS 还与盲肠微生物群（cecal microbiota）组成变化以及细菌类群（bacterial taxa）与宿主免疫和抗氧化标志物之间的相关性相关。总体而言，发酵提高了 EUPS 的得率和功能特性，突出 FEUPS 在功能性食品（functional food products）中应用的潜力。

研究背景：杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是第四纪冰川孑遗植物，具有悠久的传统中药应用历史，因其富含生物活性化合物而受到关注。2023年，国家卫生健康委员会正式将杜仲叶纳入“药用和食用物质”目录，为促进杜仲叶增值利用及其在功能性食品中的应用开辟了新机遇。杜仲叶多糖（Eucommia ulmoides leaf polysaccharides，EUPSs）是杜仲叶主要活性成分之一，是由多种单糖通过糖苷键连接形成的大分子，结构较复杂。现代研究显示，EUPSs 具有免疫增强、抗氧化、抗炎和肝保护等多种生物活性。研究人员前期发现，EUPS 可通过增强超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶活性、升高总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）并降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，在肝脏中发挥抗氧化保护作用，提示 EUPS 具有作为天然功能成分的潜在价值。然而，改善 EUPS 的理化特性和生物活性仍是其进一步开发和利用的主要挑战。基于发酵的多糖提取是一种食品级加工策略，可提高植物源多糖得率并增强其功能特性。其利用微生物生长代谢产生的酶系统降解细胞壁，促进多糖释放；同时，微生物代谢物可与多糖相互作用，改变单糖谱、分子量分布和微结构，从而影响生物活性。其中，Lactiplantibacillus plantarum 是常见食品级乳酸菌，已广泛用于食品发酵和益生菌产品开发。Wang et al. 使用 L. plantarum CICC 23121 辅助发酵从 Schisandra sphenanthera 果实中提取多糖，多糖提取率为11.12%，比热水提取高53.38%。Huang et al. 从芦笋泡菜中筛选分离出 L. plantarum JGS49，并证实该菌株发酵可显著增强芦笋汁的抗氧化活性。这些研究表明，L. plantarum 发酵可能是提高多糖提取率和生物活性的有效方法。既往研究已考察微生物发酵对杜仲产品（包括发酵茶和粗提物）的影响，也在其他植物源材料中研究了 L. plantarum 发酵，但关于 L. plantarum 发酵如何改变专门从杜仲叶中回收的多糖组分的直接证据仍有限。因此，本研究使用 L. plantarum 发酵杜仲叶，考察发酵导致的结构变化及 EUPS 的生物活性。通过比较 EUPS 与发酵杜仲叶多糖（fermented E. ulmoides leaf polysaccharides，FEUPS）的体外性质，并在环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）诱导的免疫抑制小鼠模型中评价其免疫调节作用，同时考察细菌群落与宿主免疫和抗氧化标志物之间的关系。本研究旨在确定食品级发酵是否可增强 EUPS 的理化特性和生物活性，并为 FEUPS 潜在加入功能性食品奠定基础。

关键技术与方法概述：杜仲叶于7月采自树龄5年以上树木，由河南金都中农业科技有限公司（许昌，中国）提供；L. plantarum 由河南工业大学生物工程学院动物营养实验室提供；54只健康雄性 BALB/c 小鼠购自河南 Scibes Biotechnology Co（郑州，中国），动物生产许可证号 SCXK (Yu) 2020-0005，伦理批准号 HAUTETHI2025-0923。研究人员采用 L. plantarum 固态发酵杜仲叶，比较 EUPS 与 FEUPS 的得率、单糖组成（HPAEC-PAD）、分子量（GPC）、FT-IR、SEM 和自由基清除活性；随后建立 CTX 诱导免疫抑制小鼠模型，设正常对照（CON）、模型（MOD）、FEUPS 低/中/高剂量（FEL/FEM/FEH）、EUPS 低/中/高剂量（EL/EM/EH）和盐酸左旋咪唑（LEV）组，检测体重、器官指数、H&E、ELISA、肝脏抗氧化指标、RT-qPCR 和盲肠16S rRNA基因测序，并进行统计分析。

研究结果：

3.1 抗氧化活性与 FEUPS 和 EUPS 表征：通过得率测定、单糖组成、分子量、FT-IR、SEM 和自由基清除实验，研究人员发现 FEUPS 干燥多糖回收得率达19.45%，比 EUPS 提高55.1%。FEUPS 对 DPPH^•、ABTS^•+ 和羟自由基的清除活性总体强于 EUPS。EUPS 和 FEUPS 均检测到10种单糖，以阿拉伯糖（Ara）和半乳糖（Gal）为主要单糖；其相对比例分别从 EUPS 的27.91%和36.98%升至 FEUPS 的31.14%和43.77%，而葡萄糖（Glc）相对比例从17.15%降至7.64%。EUPS 主峰约28 kDa，低分子量10–20 kDa 组分较明显，高分子量尾部较弱；FEUPS 主峰移至约37 kDa，10–20 kDa 组分减少，>80 kDa 尾部更明显，PDI 由1.55升至1.60，分子量异质性增加。FT-IR 显示3430 cm^?1、2921 cm^?1、1637 cm^?1、1572 cm^?1、1384 cm^?1和1743 cm^?1等吸收带，提示发酵后主要特征官能团基本保留。SEM 显示 EUPS 表面致密光滑，而 FEUPS 更疏松、多孔、不规则，呈颗粒和层状特征。

3.2 FEUPS 和 EUPS 对小鼠体重变化和器官指数的影响：通过记录体重和计算增重，研究人员发现 CON 组体重逐步增加，MOD 组增重较低；LEV、FEL、FEM 和 EM 组增重高于 MOD 组。MOD 组增重显著低于 CON 组，LEV、FEL、FEM 和 EM 组增重显著高于 MOD 组，并达到与 CON 组相当水平。器官指数在各组间存在数值差异，但无统计学显著性。

3.3 FEUPS 和 EUPS 对肝脏和脾脏的影响：通过 H&E 染色观察，CON 组脾脏结构保存良好，红髓和白髓分界清晰，淋巴细胞密集；MOD 组出现白髓萎缩、脾区边界模糊和淋巴细胞密度下降。各治疗组有不同程度改善，FEM 组白髓结构更清晰、淋巴细胞分布更密集，LEV 组脾脏形态更接近 CON 组。肝脏方面，CON 组肝细胞排列有序、形态正常；MOD 组肝细胞紊乱、细胞质疏松并伴局灶炎细胞浸润；LEV 和 FEM 组肝脏结构更规则，空泡化较轻。

3.4 FEUPS 和 EUPS 对血清免疫球蛋白和肝脏抗氧化状态的影响：通过 ELISA 和肝脏抗氧化试剂盒检测，MOD 组血清 IgG 和 IgM 水平显著低于对照，肝脏 CAT 和 SOD 活性、GSH 和 T-AOC 水平降低，MDA 水平升高。干预后上述指标不同程度改善。FEM 与 LEV 组在血清免疫球蛋白和肝脏抗氧化指标间无显著差异。与相应 EUPS 组相比，FEUPS 组尤其是 FEL 和 FEM 组的 IgM、SOD 活性和 T-AOC 显著升高，MDA 水平更低。总体而言，FEUPS 在部分血清免疫球蛋白和肝脏抗氧化参数上与 EUPS 存在显著差异，尤其在低剂量和中剂量。

3.5 FEUPS 和 EUPS 对脾脏相关基因表达水平的影响：通过 RT-qPCR 检测，MOD 组 T 细胞相关基因（Cd3e、Cd4、Cd8a、Cd18）、免疫调节因子（Ifng、IL-2、IL-10）和 Nrf2 表达显著降低，Bax 和 IL-6 显著上调。多糖干预后多数基因表达不同程度接近 CON 组。FEM 组在多个被测基因中表现出较明显调控作用；除 Cd8a 外，FEM 与 LEV 组在所测基因表达上无显著差异。与 EM 组相比，FEM 组 Cd3e、Cd4、Cd8a、Ifng、IL-2、IL-10 和 Nrf2 显著增加，IL-6 显著降低，而 Cd18 和 Bax 无统计学变化。

3.6 FEUPS 和 EUPS 对免疫应激小鼠肠道微生物群的影响：通过16S rRNA基因测序和多样性与组成分析，α多样性中 ACE、Chao1 和 Shannon 指数无显著组间差异，Simpson 指数存在显著差异。PCoA 和 NMDS 显示样本空间分布部分分离，NMDS stress = 0.231。基于 Bray–Curtis 距离的 PERMANOVA 显示微生物群落结构总体差异显著（R² = 0.193，F = 1.349，p = 0.008），PERMDISP 显示多元离散度无显著差异。门水平以 Bacillota 和 Bacteroidota 为主，合计超过80%；MOD 组 Bacillota 降低、Bacteroidota 升高，多糖干预后 Bacillota 相对丰度不同程度增加，FEM 和 FEH 组 F/B 比值更接近 CON 组。属水平以 norank_f__Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Desulfovibrio 和 Lactobacillus 为主；MOD 组 Lachnospiraceae_NK4A136_group 明显减少，FEUPS 干预后增加并呈剂量相关趋势，LEV 组变化最明显。热图显示 MOD 组有益菌如 Ligilactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Roseburia 和 Blautia 减少，潜在致病菌 Desulfovibrio 和 Helicobacter 增加；中、高剂量 FEUPS 和 EUPS 部分逆转这些趋势。样本聚类显示 MOD 组独立聚类，一些治疗组向 CON 组偏移，但未完全聚类。LEfSe 分析（LDA score ≥ 2）显示 CON 组主要富集 [Eubacterium]_siraeum_group 和 NK4A214_group，MOD 组主要富集 Butyricicoccaceae、Agathobacter 和 Helicobacter；FEL 组富集 Bifidobacterium，FEH 组富集 Christensenellaceae，EL 组富集 Ligilactobacillus，EH 组富集 Anaerostipes，FEM 组未发现显著富集菌群。基于群落组成分析，FEM 组微生物谱与 CON 组更相似。Spearman 相关分析经 Benjamini–Hochberg FDR 校正后，[Eubacterium] siraeum group、Colidextribacter、Alistipes、Roseburia、Ligilactobacillus、Ruminococcus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、norank_f__Muribaculaceae 和 unclassified Lachnospiraceae 与免疫和抗氧化相关参数呈正相关，而 Desulfovibrio 和 Helicobacter 通常呈相反关联模式。

讨论部分总结：原文讨论指出，L. plantarum 发酵后 EUPS 的抗氧化特性明显增强，与 Liu et al. 在发酵杜仲茶中的观察一致。这种更强活性可能与发酵期间多糖组成和理化特性改变有关。具体而言，微生物酶可能降解植物细胞壁基质并破坏氢键等相互作用，从而暴露更多还原端和供氢基团，可能有助于自由基清除。DPPH^• 和 ABTS^•+ 实验中不同浓度响应模式，可能反映两种自由基体系反应特征和所测浓度范围差异。此外，抗氧化活性以自由基清除百分比而非 Trolox 当量表示，可能限制与使用标准化抗氧化当量测定的研究进行直接定量比较。Tian et al. 报道 Bacillus sp. DU-106 发酵可改变 FDP-1 分子量，支持微生物发酵可修饰多糖特征。既往研究提示富含 Ara 的多糖可能具有更强抗氧化和免疫调节潜力。本研究中发酵改变 EUPS 单糖组成，主分子量峰移向高分子量区域。发酵后较高分子量组分比例增加，同时主要官能团基本保留，提示该变化可能与部分多糖组分聚合度增加有关，而非广泛的化学结构重建或单糖类型改变。SEM 观察到从致密、光滑、块状结构向疏松、多孔、颗粒状结构转变；这些结构变化可能增加多糖可及表面积，潜在改善其与水及生物系统的相互作用，从而增强生物活性。FEUPS 抗氧化性能改善伴随单糖组成、分子量分布和表面形态变化；基于既往研究，这些理化变化可能有助于自由基清除活性差异。同时，由于多糖制剂纯度未充分表征，且微生物胞外多糖未单独分离或定量，所观察差异不能完全归因于发酵诱导的植物源多糖修饰。体重和器官指数常作为评价小鼠生理和免疫状态的一般指标。CTX 处理显著降低体重增长，而器官指数仅见数值差异，未达统计学显著。肝脏对异物代谢和解毒至关重要，肝结构损伤通常伴随严重氧化应激和代谢紊乱；脾脏是参与 T 细胞和 B 细胞活化及免疫应答的主要次级淋巴器官。CTX 给药伴随脾脏白髓萎缩和肝细胞正常排列破坏。FEUPS 处理增加体重增长、减轻脾脏萎缩并改善白髓形态，提示在 CTX 诱导免疫抑制期间，FEUPS 可能保护脾脏结构并改善免疫功能。FEUPS 也减轻肝组织损伤，这种保护作用可能与其更强抗氧化活性有关。体液免疫对宿主防御系统至关重要，其功能常通过血清免疫球蛋白水平评价。CTX 处理后血清 IgG 和 IgM 水平显著下降，与体液免疫受损一致。多糖处理后 IgG 和 IgM 水平不同程度升高，FEM 组在所测免疫和抗氧化参数上接近 LEV 组，表明 FEUPS 可能减轻 CTX 引起的体液免疫抑制。类似地，既往研究报道发酵蛤蜊多糖可调节免疫球蛋白相关指标并改善免疫器官形态。肝脏作为 CTX 代谢的重要器官，易受其活性代谢物诱导的氧化损伤。CAT 和 SOD 是清除过氧化氢和超氧阴离子的关键抗氧化酶，GSH 作为重要非酶抗氧化剂参与过氧化物还原和自由基清除，T-AOC 提供酶和非酶抗氧化能力总体度量，MDA 是脂质过氧化的典型生物标志物。本研究中，与相应剂量 EUPS 相比，FEUPS 在若干抗氧化参数上改善更明显，尤其在低、中剂量，表现为 SOD 活性和 T-AOC 水平显著升高，MDA 水平更低。这些发现提示发酵可能进一步增强 EUPS 的体内抗氧化潜力，且与体外自由基清除活性更强一致。值得注意的是，FEM 与 LEV 组在多个免疫和抗氧化指标间无显著差异。此外，抗氧化参数未随剂量增加呈一致增加，中剂量 FEUPS 组在多个指标上改善更一致，提示抗氧化反应可能不呈简单线性剂量依赖关系。总体而言，FEUPS 缓解 CTX 诱导的氧化失衡，并在部分抗氧化参数上强于未发酵 EUPS。天然多糖在脾脏的免疫调节作用可能涉及 T 细胞相关基因和细胞因子调控。Cd3e、Cd4、Cd8a 和 Cd18 均为 T 细胞免疫应答关键基因，其中 Cd3e 参与 T 细胞活化信号转导，Cd4 和 Cd8a 分别为辅助 T 细胞和细胞毒性 T 细胞表面标志物并参与抗原识别，Cd18 介导白细胞黏附和迁移。既往研究证据表明，Mesona chinensis Benth. 多糖通过调节 T 淋巴细胞发挥免疫调节活性；其他发酵多糖也报道过类似调控作用。Nrf2 是细胞氧化还原稳态的重要调节因子，Bax 与免疫抑制应激下凋亡损伤密切相关。Ifng 和 IL-2 与细胞介导免疫应答和 T 细胞活化密切相关，IL-10 和 IL-6 参与炎症反应调控。本研究中，FEUPS 处理与脾脏 T 细胞标志物、细胞因子、抗氧化反应和凋亡相关基因 mRNA 表达变化相关。这些转录变化提示与免疫和氧化应激相关过程有关。FEUPS 干预后，这些基因表达总体向正常对照组偏移，表现为 T 细胞相关基因、免疫调节因子和 Nrf2 表达增加，IL-6 表达降低。这些发现提示 FEUPS 可能通过减轻氧化和炎症应激、抑制异常凋亡相关反应并维持 T 细胞相关免疫功能，缓解 CTX 诱导的免疫抑制。然而，由于本研究仅评估这些基因的 mRNA 表达，未进一步检测 Bax、IL-6 或相关信号蛋白的蛋白水平和激活状态，这些关系应被视为基于转录变化的假设模型，而非已确认的分子机制。发酵过程可通过微生物酶和代谢活动重塑多糖分子量谱和表面形态，这类变化可能影响肠道微生物对多糖的利用。肠道微生物群对宿主免疫稳态和氧化还原平衡至关重要。既往研究证据提示，多糖可通过改变特定细菌类群相对丰度重塑肠道微生物群落。本研究中，发酵导致 EUPS 理化特性改变，可能影响其被肠道微生物利用的程度，这些结构变化也可能为某些细菌种群生长和代谢提供更有利条件。FEUPS 干预后观察到的肠道微生物组成变化可能与这些发酵诱导的理化变化有关。LEfSe 鉴定的若干类群可能与观察到宿主反应具有生物学相关性。例如，Lachnospiraceae 成员和 Roseburia 等属常与肠道微生物代谢相关，而 Helicobacter 与肠道炎症状态有关。Ligilactobacillus 代表另一类可能与饮食干预响应的宿主相关细菌群。相关分析也表明，肠道微生物组成变化与免疫相关基因、血清免疫球蛋白和肝脏抗氧化标志物相关。FEM 组未通过 LEfSe 鉴定出显著富集类群；群落组成分析提示 FEM 组整体微生物谱比部分其他治疗组更接近 CON 组。虽然这些相关分析表明肠道微生物组成变化、宿主免疫功能和抗氧化状态之间存在关联，但不能证明二者直接因果关系。需要结合短链脂肪酸分析和抗生素干预的进一步研究，以深入探究肠道微生物群对 FEUPS 免疫调节作用的贡献。

研究结论翻译：本研究证明，使用 Lactiplantibacillus plantarum 进行固态发酵改变了从杜仲叶中回收的多糖组分的理化特性并增强其功能活性。发酵还使干燥多糖组分的回收得率较未发酵提取提高55.1%。与未发酵 EUPS 相比，FEUPS 表现出更强的体外抗氧化活性，同时单糖组成和分子量谱发生变化，表面结构更开放、多孔。在体内，FEUPS 与 CTX 处理小鼠体重增长、组织学特征、血清免疫球蛋白水平、肝脏抗氧化指标、脾脏基因表达和盲肠微生物群组成的变化相关。这些发现支持 FEUPS 制剂的抗氧化和免疫调节潜力，但未建立特定信号通路、淋巴细胞功能变化或微生物群介导机制。此外，由于多糖制剂的纯度未充分表征，且微生物胞外多糖未单独定量，所观察到的效应不能完全归因于经发酵修饰的植物源多糖。需要进一步的蛋白水平、细胞和机制研究。