克里奥罗可可（Theobroma cacao L.）自然发酵过程中微生物分子鉴定、果胶分解潜力与挥发性化合物形成的动态特征研究

《Foods》：Molecular Characterization of Microorganisms, Pectinolytic Potential and Volatile Compound Formation During Spontaneous Fermentation of Criollo Cacao (Theobroma cacao L.)

　　

摘要 克里奥罗可可（Criollo cacao）的自然发酵涉及可培养微生物的时序变化以及挥发性化合物谱的动态演变，这对可可特征香气相关品质的形成具有潜在影响。本研究旨在鉴定可培养微生物，评估其表观果胶分解潜力（apparent pectinolytic potential），并解析秘鲁亚马孙大区Lagunas农村社区克里奥罗可可自然发酵过程中挥发性化合物的时序动态。研究人员在不同发酵阶段分离微生物，并通过在以果胶为唯一底物的无机盐培养基上筛选果胶降解透明圈来评估其果胶分解潜力。对代表性分离菌株，分别通过ITS区域（internal transcribed spacer region）测序鉴定酵母菌、通过16S rRNA基因测序鉴定细菌。挥发性化合物采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）技术进行分析。所有参与果胶试验的分离菌株均产生可见降解圈，但透明圈直径与面积在不同菌株间存在差异，提示其表观果胶分解潜力存在差异。分子鉴定结果显示，酵母菌中频繁分离到库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与奥普蒂阿汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae），而细菌中醋杆菌属（Acetobacter）物种被频繁检出。挥发性化合物谱分析显示，醇类、酯类、醛类、酮类、萜烯类、酸类及其他化合物家族相对丰度呈现时序变化。探索性Spearman相关分析揭示了微生物分离频率与挥发性有机化合物（VOC）家族之间存在若干强时序关联，尤其涉及P. kudriavzevii、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）、热带醋杆菌（A. tropicalis）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。然而，经多重比较校正后，上述关联均不再具有统计学显著性。总体而言，本研究将培养依赖法、分子鉴定、果胶分解筛选与挥发性化合物谱分析相结合，为克里奥罗可可自然发酵过程中可培养微生物与挥发性化合物之间的协同时序模式提供了初步证据，并筛选出可供进一步功能评价的候选菌株。

克里奥罗可可自然发酵：微生物动态、果胶分解潜力与挥发性化合物形成的整合解析

一、研究背景与意义

可可（Theobroma cacao L.）是全球重要的经济作物，也是巧克力生产的主要原料。在秘鲁东北部，克里奥罗（Criollo）、佛拉斯特罗（Forastero）、特立尼塔里奥（Trinitario）和CCN-51等品种均有栽培，其中克里奥罗因其生物活性成分和感官特性而备受重视。在亚马孙大区，尤其是Utcubamba和Bagua两省，克里奥罗是当地重要的经济作物。

可可自然发酵过程涉及酵母菌、乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）和醋酸菌（acetic acid bacteria, AAB）的协同作用，但各类微生物的相对丰度受可可基因型、发酵条件、地理来源以及微生物表征分析方法等多种因素影响。这些微生物的代谢活动能够转化糖类及其他果肉成分，进而促进挥发性化合物和香气前体物质的形成。由于自然发酵本身具有高度变异性，因此开发发酵剂（starter cultures）以及对本地微生物群进行系统表征，成为提升发酵一致性和可可品质的重要策略。

近年来，基于DNA的分子生物学技术，尤其是高通量测序，已能够更全面地揭示可可发酵过程中微生物群落的组成及其动态变化和潜在代谢功能。已有研究也报道了可可发酵过程中微生物群落组成与挥发性化合物产生之间的关联。然而，关于秘鲁亚马孙大区Utcubamba省Cajaruro区Lagunas农村社区所产克里奥罗可可的可培养微生物群及其挥发性化合物谱的信息仍然十分有限，而该地区正是克里奥罗可可的重要产区。因此，本研究旨在系统鉴定克里奥罗可可自然发酵过程中的可培养微生物，通过琼脂平板筛选试验评估其果胶分解潜力，并解析发酵过程中挥发性化合物的时序动态，为理解微生物动态与可可风味形成之间的关系提供基础数据。

二、主要技术方法

研究人员从秘鲁亚马孙大区Lagunas农村社区采集1800 kg新鲜克里奥罗可可豆，等量分配至三个木制发酵箱中（每箱600 kg），在APROCAM合作社进行144 h自然发酵，并于0、24、48、72、96、120和144 h七个时间点采集样品。三个发酵箱来自同一批次可可并在相同条件下同步运行，被视为平行发酵单元而非独立生物学重复。微生物分离采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板划线法，随后在YPD和MRS培养基上进行纯化。果胶分解潜力通过含果胶无机盐培养基上的透明圈形成试验评估，并以透明圈/菌落直径比（halo-to-colony ratio, HCR）作为比较指标。分子鉴定分别通过ITS区域和16S rRNA基因的PCR扩增及Sanger测序完成。挥发性化合物采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）技术分析，对可可豆、可可豆种皮及微生物样品三种基质分别进行检测。

三、研究结果

3.1 形态学分析与果胶降解透明圈

所有分离菌株在果胶筛选试验中均产生可见的降解透明圈，透明圈面积范围为41.01至63.64 cm2，表明不同菌株的表观果胶分解潜力存在差异。大多数菌株表现出中等透明圈形成能力，仅少数菌株产生大于60 cm2的透明圈。在0 h时，酵母菌落密度较高，这可能与新鲜可可粘液中发酵底物的可利用性有关。细菌在初始阶段生长适中，随着发酵进行，醋酸菌在多个阶段被检出，而其他细菌类群主要在后期的检出频率较高。144 h时细菌透明圈边界更加清晰，提示后期分离的某些细菌菌株在体外条件下表现出更强的透明圈形成能力。酵母菌的HCR值在发酵过程中呈现时序变化，初始阶段较高，后期部分菌株的HCR值降低。细菌的HCR值在48 h后开始增加，在72至96 h达到最大值，120至144 h仍保持较高水平。

3.2 酵母菌和细菌的分子鉴定

ITS区域测序鉴定出三种酵母菌：库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和曼氏毕赤酵母（Pichia manshurica）。P. kudriavzevii在0至72 h早期阶段检出频率最高，S. cerevisiae主要在72至120 h之间被检出，P. manshurica在120 h被检出。16S rRNA基因测序鉴定出以醋杆菌属（Acetobacter）为主的醋酸菌，包括巴氏醋杆菌（A. pasteurianus）、热带醋杆菌（A. tropicalis）、A. fabarum和A. ghanensis，以及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）、Lysinibacillus phoenicis、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。A. pasteurianus在24至120 h多个发酵阶段检出频率最高，B. subtilis也被反复检出，而P. putida和S. epidermidis仅在144 h被检出。

3.2.1 微生物群落的时序动态

可培养微生物的时间分布显示，酵母菌和醋酸菌在多个发酵阶段被检出，芽孢杆菌从72 h起检出频率增加，其他细菌类群仅在144 h被检出。酵母菌在初始阶段检出频率较高，与可可果肉中可发酵糖的可利用性一致；醋酸菌在多个阶段与酵母菌同时被检出；芽孢杆菌从72 h起检出频率增加，可能与其对发酵环境胁迫的耐受能力有关。

3.2.2 可培养酵母属的时序分布

毕赤酵母属（Pichia）在前72 h检出频率较高，酿酒酵母属（Saccharomyces）在72至120 h之间检出频率增加，96 h时达到最高。这一时序转换与发酵过程中底物消耗和乙醇积累等条件变化相一致。

3.2.3 可培养细菌属的时序分布

醋杆菌属（Acetobacter）是各发酵阶段检出频率最高的细菌属，芽孢杆菌属（Bacillus）从72 h起检出频率增加并持续至144 h，Lysinibacillus、Pseudomonas和Staphylococcus主要在发酵末期零星检出。

3.3 挥发性化合物分析

聚类分析识别出四个具有不同化学特征的组群。Cluster 3主要由0、24和48 h的酵母样品及0 h的种皮样品组成，对应发酵早期阶段；Cluster 2包含0至120 h的可可豆样品；Cluster 1包含大多数细菌样品及96至144 h的豆和种皮样品；Cluster 4仅由144 h的细菌样品组成，具有独特的挥发性化合物谱。主成分分析（PCA）显示，第一维度解释38.6%的变异性，第二维度解释24.1%，合计解释62.7%的总方差。醇类与第一维度的负值相关，酸类和"其他"类化合物呈正相关，酯类主要与第二维度的正轴相关。

3.3.1 醇类

在三种基质中，醇类在发酵早期（0至48 h）相对丰度最高。可可豆中醇类在0 h约为33%，48 h达到最大值约45%，随后逐渐下降至144 h的约17%。种皮中醇类在0 h约为40%，随后逐渐下降。微生物样品中醇类在0 h几乎检测不到，24 h急剧增加至62%，48 h达到约83%的最高值，随后在细菌主导阶段（72至144 h）下降。

3.3.2 酯类

酯类在三种基质中呈现不同的时序模式。可可豆中酯类从0 h的几乎检测不到逐渐增加，120 h达到最高相对丰度约27%。种皮中酯类在0至96 h相对丰富（约30%至35%），144 h下降至约17%。微生物样品中酯类在0 h达到最高约48%，随后逐渐下降，144 h降至约1%。

3.3.3 酸类

酸类在三种基质中均随发酵进程逐渐增加。可可豆中酸类的增加与有机酸从粘液向豆内扩散一致。种皮中酸类的增加可能与直接接触发酵粘液及代谢产物转移有关。微生物样品中酸类相对丰度较高，与醋酸菌将乙醇氧化为乙酸的活动一致。

3.3.4 醛类

醛类在三种基质中呈现不同模式。可可豆中醛类在发酵最早期相对丰度最高（0 h/pod至0 h约22%至35%），随后逐渐下降至144 h的约5%。种皮中醛类从初始约3%增加至120 h的约12%，随后在144 h急剧下降至约3%。微生物样品中醛类在整个过程中维持在较低且相对稳定的水平。

3.3.5 酮类

可可豆中酮类在整个发酵过程中波动（约8%至16%），144 h达到最高约20%。种皮中酮类在大部分发酵过程中相对稳定（约8%至15%），144 h急剧下降至约4%。微生物样品中酮类在0至48 h几乎检测不到，72 h首次检出，96 h达到最高约33%。

3.3.6 萜烯类和碳氢化合物

可可豆中萜烯类和碳氢化合物在发酵前阶段（0 h/pod）最丰富（萜烯类约20%，碳氢化合物约9%），随后急剧下降并维持低水平。种皮中萜烯类在48至72 h达到最高（约17%至18%），随后下降至144 h的约2%。微生物样品中碳氢化合物仅在0 h短暂检出（约10%），萜烯类在整个过程中可忽略不计。

3.3.7 其他化合物

"其他"类化合物主要包括内酯及含硫和含氮化合物。可可豆中该类化合物从初始约3%逐渐增加至72至144 h的约7%至11%。种皮中从0 h的约0%增加至96至144 h的约8%至10%。微生物样品中该类化合物在0至120 h几乎检测不到，144 h急剧增加至约75%，主要与1,2-二甲基肼（1,2-dimethylhydrazine）的检出有关。

3.3.8 主要化合物的动态

酯类中，3-甲基-1-丁醇乙酸酯从24 h起增加，在发酵中后期丰度较高；乙酸-2-苯乙酯在144 h达到最高丰度。醇类中，3-甲基-1-丁醇在24至48 h增加后逐渐下降；芳樟醇（linalool）在0 h相对丰度最高。种皮中酯类在0 h丰度最高，随后逐渐下降。微生物样品中酯类在0 h最丰富，乙酸乙酯在72至120 h之间增加，96 h达到最大值。

3.4 可培养微生物与挥发性化合物家族的相关性

Spearman相关分析显示，巴氏醋杆菌（A. pasteurianus）与"其他"挥发性化合物家族的相对丰度呈最高正相关（ρ = 0.927, p = 0.003），枯草芽孢杆菌（B. subtilis）与酯类呈正相关（ρ = 0.852, p = 0.015），A. pasteurianus与酚类呈正相关（ρ = 0.846, p = 0.016）。库德里阿兹威毕赤酵母（P. kudriavzevii）与醇类呈正相关（ρ = 0.842, p = 0.017），与酯类呈负相关（ρ = ?0.805, p = 0.029）。热带醋杆菌（A. tropicalis）与酯类、酸类和"其他"类呈强负相关（ρ = ?0.802），与碳氢化合物呈正相关（ρ = 0.802）。然而，经Benjamini-Hochberg多重比较校正后，132项微生物-挥发性化合物关联均不再具有统计学显著性（所有校正后p值 > 0.05）。

四、讨论与结论

本研究将培养依赖法、分子鉴定、果胶分解筛选和挥发性化合物谱分析相结合，系统揭示了克里奥罗可可自然发酵过程中可培养微生物与挥发性化合物之间的时序关联。酵母菌在发酵早期占主导，其中P. kudriavzevii和S. cerevisiae的检出频率与醇类和酯类的相对丰度变化在时间上吻合；醋酸菌在发酵中后期活跃，A. pasteurianus的检出与酸类及"其他"类化合物的增加在时间上一致。所有分离菌株均表现出一定的果胶分解潜力，这可能在粘液降解和发酵环境改变中发挥作用。然而，由于培养依赖法的局限性以及缺乏独立生物学重复，上述关联应被视为探索性时序共变而非因果证据。本研究筛选出的候选菌株为后续菌株水平功能研究和受控发酵试验奠定了基础，有助于进一步阐明特定微生物对可可香气形成的贡献。