基于金纳米颗粒IGRA与ELISA的SARS-CoV-2体液与细胞免疫整合评估

《International Journal of Molecular Sciences》：Integrated Assessment of Humoral and Cellular SARS-CoV-2 Immunity Using ELISA and a Gold Nanoparticle-Based IGRA

尽管SARS-CoV-2免疫已被广泛研究，但不同暴露途径后抗体水平与细胞免疫应答之间的关系仍未完全阐明。本研究采用一种新开发的基于金纳米颗粒（AuNP）偶联SARS-CoV-2抗原的全血干扰素-γ释放试验（nano-IGRA）评估细胞免疫。研究人员在112名通过感染、疫苗接种或两者兼有的方式获得免疫的个体中，比较了AuNP偶联抗原与可溶性抗原在干扰素-γ（IFN-γ）应答以及批内和批间重复性方面的表现。体液免疫通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行评估。总体而言，88%的参与者血清阳性。在所有暴露组中，AuNP偶联的SARS-CoV-2刺突蛋白（S）和核衣壳蛋白（N）抗原诱导的IFN-γ应答显著高于可溶性抗原（p < 0.001）。AuNP偶联使S和N的批内变异分别降低62.4%和61.4%，批间变异分别降低71.7%和68.3%。抗体水平与S蛋白（ρ = 0.358，p < 0.001）和N蛋白（ρ = 0.309，p < 0.001）诱导的IFN-γ应答显著相关。一个有趣的发现是，部分血清阴性个体中也检测到了细胞免疫应答。基于新型AuNP策略的nano-IGRA可提供抗原特异性细胞免疫评估，在增强IFN-γ应答的同时提高了重复性。未来研究应确定诊断截断值、灵敏度、特异性和临床性能。

**论文解读：基于金纳米颗粒IGRA与ELISA的SARS-CoV-2体液与细胞免疫整合评估**

**一、研究背景与目的**

2020年初，严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引发的COVID-19疫情被世界卫生组织（WHO）宣布为大流行，全球累计死亡人数超过710万，给卫生系统、社会生活和全球经济造成了巨大负担。SARS-CoV-2感染和/或疫苗接种可诱导强烈的体液免疫和细胞免疫应答，这两类免疫应答的评估对于疫苗策略开发、变异株监测以及理解COVID-19免疫病理机制具有重要意义。虽然抗体滴度测量是病毒感染检测的常规手段，但T细胞免疫在COVID-19中同样受到广泛关注，特别是在未发生血清转化的个体、无症状或轻症感染者、免疫受损人群及接受免疫抑制治疗的患者中，T细胞免疫的存在已被证实是评估保护性免疫的重要补充指标。

然而，目前对不同抗原暴露途径（自然感染、疫苗接种、感染加疫苗接种）下SARS-CoV-2特异性体液免疫与细胞免疫之间关系的认识仍不充分，且缺乏对抗体应答水平与病毒特异性T细胞应答水平之间可能关联的系统性检验。此外，虽然干扰素-γ释放试验（IGRA）已被证明是检测COVID-19细胞介导免疫的重要实用诊断工具，但即便在相同条件下重复测试，其重复性不足仍是限制性问题。

针对上述问题，本研究旨在通过引入金纳米颗粒（AuNP）偶联SARS-CoV-2抗原，开发一种新型全血IGRA方法（nano-IGRA），以提高IGRA测试的重复性和灵敏度，并利用该平台整合酶联免疫吸附试验（ELISA），系统评估不同SARS-CoV-2暴露途径下体液免疫与细胞免疫应答之间的互补关系。

**二、研究设计与方法概述**

研究人员于2020年8月至2022年3月期间，在塞尔维亚贝尔格莱德核能应用研究所（INEP）开展了一项横断面研究，共纳入112名参与者，根据免疫应答来源分为三组：COVID-19感染恢复期患者组（n = 37）、疫苗接种组（n = 35，接种前PCR阴性、抗体低于截断值且无COVID-19症状）以及感染加疫苗接种的混合免疫组（n = 40）。体液免疫采用基于RBD-S蛋白的ELISA试剂盒（INEP-塞尔维亚开发的IVD医疗器械）检测SARS-CoV-2 IgG抗体，依据IgG指数将参与者分为血清阴性（指数< 20）、低度血清阳性（20 ≤ 指数 < 40）、中度血清阳性（40 ≤ 指数 < 80）和高度血清阳性（指数≥ 80）四类。细胞免疫采用自建的nano-IGRA，使用AuNP偶联的SARS-CoV-2刺突蛋白（S）和核衣壳蛋白（N）作为T细胞刺激抗原，以可溶性抗原为平行对照，在肝素化全血中进行刺激后测定血浆中释放的IFN-γ浓度，并对AuNP偶联与可溶性抗原诱导的IFN-γ应答进行批内和批间重复性比较。IFN-γ浓度采用Human IFN-g ELISA Set（BD Biosciences Pharmingen）测定。统计分析采用Student's t检验、Mann-Whitney检验、Wilcoxon符号秩检验及Spearman等级相关系数，所有检验为双侧，p < 0.05视为有统计学意义。

**三、主要研究结果**

**3.1 体液免疫结果**

在112名受试者中，99名（88%）检测到可测量的SARS-CoV-2特异性IgG抗体（血清阳性），13份样本（12%）为血清阴性。按组别分析，COVID-19感染组、疫苗接种组和混合免疫组的血清阳性率分别为86%（n = 32）、83%（n = 29）和95%（n = 38）。混合免疫组中血清阴性的比例（5%）仅为其他两组（14%和17%）的三分之一左右，而高度血清阳性的比例（32%）约为其他两组（22%和17%）的近两倍。总体而言，无论免疫获得方式如何，每三人中约一人为低度（32%）或中度（31%）血清阳性，每四人中有一人为高度血清阳性（25%）。

**3.2 细胞免疫结果与nano-IGRA方法学性能**

nano-IGRA方法学评估显示，与对应可溶性抗原刺激相比，AuNP偶联抗原在三个研究组中均一致性地降低了批内变异：在感染组中，S蛋白批内变异系数（CV）从8.3%降至3.2%，N蛋白从7.4%降至3.6%；在疫苗接种组中，S蛋白CV从7.3%降至2.8%，N蛋白从7.7%降至2.7%；在混合免疫组中，S蛋白CV从6.9%降至2.5%，N蛋白从7.0%降至2.2%。批间重复性改善更为显著：感染组S蛋白CV从10.5%降至3.5%，N蛋白从10.1%降至2.9%；疫苗接种组S蛋白CV从15.0%降至3.6%，N蛋白从15.3%降至4.7%；混合免疫组S蛋白CV从12.8%降至3.8%，N蛋白从10.2%降至3.7%。三个组汇总分析显示，AuNP偶联使S蛋白和N蛋白的平均批内CV分别降低62.4%和61.4%，平均批间CV分别降低71.7%和68.3%。同时，AuNP偶联抗原诱导的IFN-γ浓度在三个研究组中均显著高于可溶性抗原刺激（p < 0.001），表明该方法在提高重复性的同时增强了检测灵敏度。

**3.2.1 COVID-19感染组**

在感染恢复期患者中，S蛋白诱导的T细胞应答随抗体水平升高呈递增趋势：血清阴性组中位IFN-γ水平最低（980 pg/mL），低度、中度和高度血清阳性组分别为1380、1460和1625 pg/mL，但各组间差异未达到统计学意义。N蛋白诱导的IFN-γ应答在高度血清阳性组（IgG指数≥ 80）达到最高值（2128 pg/mL），血清阴性组与低、中度血清阳性组水平相近，各组间无显著差异。值得关注的是，血清阴性的PCR阳性患者中仍可检测到针对S蛋白和N蛋白的T细胞应答。

**3.2.2 疫苗接种组**

在无既往感染史的疫苗接种者中，S蛋白诱导的IFN-γ水平呈现与感染组相似的随抗体滴度递增的分布：血清阴性组为940 pg/mL，低、中、高度血清阳性组分别为1322、1970和2528 pg/mL，其中血清阴性组与高度血清阳性组之间的差异具有统计学意义（p = 0.007）。N蛋白诱导的应答中，血清阴性组中位IFN-γ值最低（965 pg/mL），血清阴性组与低度血清阳性组之间存在显著差异（p = 0.0083）。

**3.2.3 COVID-19感染+疫苗接种组**

在混合免疫组中，S蛋白诱导的IFN-γ应答在血清阴性组中位值为1242 pg/mL，高度血清阳性组最高（2120 pg/mL），血清阴性组与高度血清阳性组（p = 0.043）以及中度与高度血清阳性组（p = 0.046）之间的差异均具有统计学意义。N蛋白诱导的细胞免疫应答随抗体水平呈递增分布：血清阴性组1325 pg/mL，低度1700 pg/mL，中度2240 pg/mL，高度2368 pg/mL，其中血清阴性组与高度血清阳性组（p = 0.004）以及低度与中度血清阳性组（p = 0.034）之间差异显著。

**3.2.4 三组间T细胞应答比较**

在具有相同血清状态的参与者中比较三组的IFN-γ水平，结果显示：在血清阴性类别中，11名参与者尽管缺乏体液应答但仍检测到IFN-γ释放，其中自然感染组表现出较强的细胞免疫反应性。在低度血清阳性类别中，三组的T细胞应答较为均匀。在中度和高度血清阳性类别中，混合免疫（感染加疫苗接种）组诱导的IFN-γ释放浓度最高，表明感染与疫苗接种的联合效应可产生最强的T细胞免疫应答。然而，在相同血清状态下，三组间的SARS-CoV-2 IGRA反应性差异均未达到统计学意义（p > 0.05）。

**3.2.5 体液与细胞免疫应答的相关性**

Spearman相关分析显示，在疫苗接种组中，IgG指数与S蛋白诱导的IFN-γ应答呈显著正相关（ρ = 0.475，p = 0.004），但与N蛋白诱导的应答无显著相关（ρ = 0.085，p = 0.626）。在混合免疫组中，IgG指数与S蛋白诱导（ρ = 0.412，p = 0.0083）及N蛋白诱导（ρ = 0.371，p = 0.0185）的IFN-γ应答均呈显著正相关。在感染组中，未观察到显著的统计学相关性（S蛋白：ρ = 0.239，p = 0.153；N蛋白：ρ = 0.215，p = 0.202）。将所有参与者合并分析时，IgG指数与S蛋白（ρ = 0.358，p < 0.001）和N蛋白（ρ = 0.309，p < 0.001）诱导的IFN-γ应答均呈显著正相关。

**四、讨论与结论**

本研究的核心发现是AuNP偶联抗原刺激相比传统可溶性抗原刺激可显著提高IFN-γ释放并大幅降低批内和批间变异，这一改善效应在感染、疫苗接种和混合免疫三种不同暴露背景中均保持一致。AuNP偶联可能通过增强抗原与免疫细胞的体外相互作用、提高系统稳定性和生物相容性来实现这一效果。本研究所提出的nano-IGRA平台据研究人员所知是首次将AuNP偶联SARS-CoV-2抗原整合到全血IGRA体系中的尝试。

研究同时发现，体液免疫与细胞免疫之间存在一定的正相关关系，尤其是在疫苗接种和混合免疫人群中相关性更为显著，表明联合评估两类免疫应答可为SARS-CoV-2免疫状态的全面评价提供更丰富的信息。此外，部分血清阴性个体中存在可检测的T细胞应答，提示细胞免疫可提供独立于体液免疫的补充信息。

研究结论指出，新型AuNP策略的nano-IGRA有效提升了SARS-CoV-2特异性细胞免疫评估的应答强度和检测重复性，并为体液-细胞免疫联合评估提供了可行的方法学基础。该平台的模块化特性还可扩展至其他感染性疾病乃至过敏原特异性免疫应答的检测。研究人员同时指出，本研究的局限性在于未与商业化SARS-CoV-2 IGRA进行直接对比，且尚未建立诊断截断值、临床灵敏度和特异性，未来需在更大规模、特征明确的研究队列中开展全面的临床验证研究。