《Macromol》：3D GelMA-Printing of Pancreatic Endocrine Constructs via Magnetic Chitosan Nanoparticle-Mediated CRISPR/dCas9a Delivery: A Proof-of-Concept Study
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糖尿病影响全球近五亿人口，其主要病因是胰岛素产生细胞的缺失，而这类细胞对维持正常血糖水平至关重要。在本研究中，研究人员优化了一种基于失活Cas9（dCas9）的CRISPR激活（CRISPRa）系统，用于转染HEK293细胞，并随后将其分化为功能性α样、β样和
糖尿病影响全球近五亿人口，其主要病因是胰岛素产生细胞的缺失，而这类细胞对维持正常血糖水平至关重要。在本研究中，研究人员优化了一种基于失活Cas9（dCas9）的CRISPR激活（CRISPRa）系统，用于转染HEK293细胞，并随后将其分化为功能性α样、β样和δ样细胞，作为工程学概念验证。该CRISPRa系统靶向多个基因，包括NGN3、NKX6.1 + MAFA和PDX1，并通过免疫染色证实成功诱导了细胞分化。这些细胞被封装于3D打印的GelMA圆盘中，并在30天内持续监测胰高血糖素、胰岛素和生长抑素的分泌情况。
论文解读文章
一、研究背景与问题
糖尿病是一种全球性代谢紊乱疾病，目前影响全球近五亿人。该疾病以慢性高血糖为特征，其根本原因在于胰岛素分泌不足或胰腺β细胞功能障碍。胰腺β细胞在维持血糖稳态中发挥关键作用。1型糖尿病（T1DM）是一种自身免疫性疾病，表现为胰腺β细胞破坏和胰岛素分泌不足；2型糖尿病（T2DM）则以胰岛素抵抗和进行性β细胞功能障碍为特征。
过去十年中，再生医学领域致力于开发从诱导多能干细胞（iPSCs）分化功能性干细胞来源β细胞（SC-β）的方案。iPSCs可从外周血单核细胞或真皮成纤维细胞等成体体细胞重编程获得，并通过调控胰腺发育相关信号通路分化为功能性β细胞。这一复杂的成熟过程依赖于PDX1、NKX6.1、SOX9、NGN3和PAX4等关键核心转录因子的时序协调。然而，与成人原代细胞相比，传统iPSC来源的SC-β细胞常表现出生理功能缺陷，如总胰岛素输出减少、关键发育转录因子基线表达水平降低，以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）动力学异常。
与此同时，先进生物工程技术为细胞递送和蛋白质提取提供了新平台。分子印迹聚合物（MIPs）在靶标生物传感、精准药物递送和磁分离领域具有广泛应用前景。该研究团队此前已成功利用磁性肽印迹壳聚糖纳米颗粒进行表位识别以提取CRISPR/Cas9a蛋白，并利用纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9a激活系统工程化功能性胰岛素产生细胞簇。为将这些工程化细胞转化为功能性组织构建体，3D生物打印技术采用甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶作为支架材料。GelMA凭借优异的生物相容性、仿生细胞外基质特性和高度可调的力学性能，已成为首选工程支架。通过先进生物打印平台，研究人员可构建包含封装胰岛细胞的有序胰腺构建体，从而显著改善局部血管化潜力及长期血糖控制效果。
二、研究内容与核心结论
本研究以人胚胎肾（HEK293）细胞为宿主，通过优化的CRISPR激活（CRISPRa）系统递送靶向NGN3、NKX6.1 + MAFA和PDX1的dCas9-VPR核糖核蛋白（RNPs），成功将HEK293细胞分化为功能性α样、β样和δ样内分泌细胞。这些分化细胞随后悬浮于优化的GelMA生物墨水中，采用直写式3D生物打印技术构建人工胰腺构建体。研究结果表明，该3D打印构建体能够在30天内持续分泌胰高血糖素、胰岛素和生长抑素，且3D培养条件下的激素分泌水平显著高于2D对照组，其中胰高血糖素和生长抑素分泌水平分别约为2倍和6倍。该研究为长期糖尿病管理提供了具有前景的平台，并为未来临床应用奠定基础。
三、关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：基于磁性肽印迹壳聚糖纳米颗粒（MPIPs）的dCas9-VPR蛋白提取与CRISPRa核糖核蛋白（RNPs）递送系统；直写式3D生物打印技术（DP-200E生物打印机）结合GelMA水凝胶生物墨水构建人工胰腺构建体；免疫荧光染色（IF）和定量实时PCR（qRT-PCR）用于细胞分化鉴定和基因表达分析；酶联免疫吸附测定（ELISA）用于激素分泌水平检测；Live/Dead细胞活力检测评估打印后细胞存活率。
四、研究结果
4.1 细胞分化与基因表达分析
免疫荧光染色证实HEK293细胞成功分化为α样、β样和δ样细胞，分别表达胰高血糖素、胰岛素和生长抑素，且分化细胞形成聚集体，激素定位于细胞质内。qRT-PCR分析显示，经CRISPRa靶向递送NGN3、NKX6.1 + MAFA和PDX1后，第3天各靶基因转录水平显著上调：PDX1（30.1 ± 1.8倍）、NGN3（27.5 ± 1.4倍）、NKX6.1（28.6 ± 1.6倍）和MAFA（27.4 ± 1.5倍）。这些表达水平的细胞内衰减半衰期约为3周，与30天激素分泌动力学特征相吻合。此外，葡萄糖刺激后，PKA、PI3K和mTOR等关键信号通路显著上调。
4.2 3D打印参数优化与细胞活力
研究人员测试了0.25至0.75 kg/cm2的挤出压力对打印图案保真度和细胞活力的影响。0.75 kg/cm2压力导致生物墨水过度沉积和水凝胶增宽，损害结构分辨率；而0.50 kg/cm2压力实现了最佳平衡，保持高细胞活力（75 ± 5%）和清晰的建筑几何结构。7% GelMA水凝胶经60秒UV交联后压缩模量约为15 kPa，为细胞打印和长期培养提供了适宜的力学性能。
4.3 构建体细胞分布与结构特征
免疫荧光图像显示，3D打印人工胰腺构建体中β样细胞均匀分布，α:β:δ细胞比例保持2:7:1。然而，由于非血管化高密度水凝胶基质中溶解氧传输受被动扩散限制（有效扩散距离约150–200 μm），打印纤维直径超过400 μm时，纤维核心区域因细胞增殖导致局部缺氧，进而下调ATP依赖性胞吐途径，这解释了30天内激素释放的衰减现象。
4.4 激素分泌动力学
30天监测期内，α样细胞胰高血糖素分泌在2D培养第6天和3D构建体第9天显著下降（25–28 pg/mL降至8–16 pg/mL）；β样细胞胰岛素分泌从第3天的13–14 μIU/mL降至第30天的4–7 μIU/mL；δ样细胞生长抑素分泌从约7.71 ± 0.03 ng/mL降至约5.0 ng/mL。所有培养均不含外源胰岛素，因此检测到的激素均来源于细胞自身合成。未转染对照组和未靶向RNPs处理组胰岛素分泌极低（<0.5 μIU/mL），非印迹颗粒（MNIPs）和无特异性gRNA递送的dCas9-VPR仅产生极低背景激素水平（2.6 ± 0.1 μIU/mL），而靶向CRISPRa递送使刺激后胰岛素输出提升至11–12 μIU/mL。关键发现是3D培养在各时间点的激素分泌水平均高于2D对照。
五、讨论与结论
研究结果表明，3D GelMA打印构建体能够维持30天的持续激素分泌，且3D培养条件下胰高血糖素和生长抑素分泌水平分别约为2D对照的2倍和6倍，显示出显著增强的性能。然而，本研究存在根本性局限：依赖HEK293细胞系，尽管该细胞系具有快速增殖、高转染效率和稳定的挤出生物打印流变学稳定性等优点，但转化细胞系不能作为胰腺胰岛器官发生的真实生物学替代物。总体而言，3D GelMA基人工胰腺构建体作为长期糖尿病管理平台展现出巨大潜力，可为未来临床转化应用铺平道路。
