《Toxics》：Comparison of Toxicity of Heavy Metals and Rare Earth Elements in Zebrafish Larvae and Daphnia magna Neonates Using a Phenomics Approach with Multiple Locomotor Activity Endpoints
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重金属（HMs）和稀土元素（REEs）作为环境污染物持续存在，在水生生态系统中累积，对水生生物构成风险。尽管重金属的毒性已得到充分证实，但稀土元素的生态和生物影响相对而言仍探索不足，尽管其工业用途正在不断扩大。在本研究中，研究人员采用斑马鱼（Danio rer
重金属（HMs）和稀土元素（REEs）作为环境污染物持续存在，在水生生态系统中累积，对水生生物构成风险。尽管重金属的毒性已得到充分证实，但稀土元素的生态和生物影响相对而言仍探索不足，尽管其工业用途正在不断扩大。在本研究中，研究人员采用斑马鱼（Danio rerio）幼鱼和大型蚤（Daphnia magna）新生幼体作为互补的水生模型，利用其快速发育特性和适用于高通量行为分析的优点，对各金属类群的毒理学效应进行比较评估。两种物种均暴露于17种重金属和16种稀土元素，暴露浓度范围依据物种特异性指导原则设定，以确定半数致死浓度（LC50），随后在亚致死浓度下进行24小时行为评估，并采用优化的高通量方案。研究人员分析了13个行为终点，以全面表征运动活性、空间探索和运动复杂性。采用主成分分析（PCA）和热图聚类评估多变量行为模式。结果揭示了显著的物种特异性和金属特异性毒性特征，其中若干稀土元素诱导的行为效应与某些重金属相当甚至超过后者。值得注意的是，同一化合物在斑马鱼幼鱼和大型蚤中的行为反应存在差异，凸显了物种特异性敏感性，并强调了多物种评估在环境风险评估中的价值。
论文解读
一、研究背景与科学问题
重金属（HMs）是自然界中存在的具有高原子量和密度的元素，其在工业、农业和技术领域的广泛使用导致其在环境中普遍存在。铬（Cr）、钴（Co）、铁（Fe）、锰（Mn）、镍（Ni）、钒（V）等重金属因在水生环境中具有高溶解性和生物可利用性而尤其令人关注。重金属具有持久性和生物累积性，可对非靶标水生生物造成伤害，破坏生态平衡，并对生物多样性构成威胁。传统毒性评估主要关注死亡率和发育缺陷等终点，但近年研究强调行为终点作为神经毒性和生态影响风险的敏感标志物的重要性。
稀土元素（REEs）天然存在于地壳中，也存在于海洋、河流和湖泊等水生环境中，浓度范围为每升纳克至微克级。稀土元素包括17种化学性质相似的金属，涵盖15种镧系元素以及钪（Sc）和钇（Y）。这些金属通过采矿、高科技制造和电子废物处置日益进入水生系统。尽管已有研究表明稀土元素可对多种水生生物产生生物学和生态学效应，包括抑制生长、引起发育畸形、使生物固定化以及改变生物标志物反应，但其毒性特征与已广泛研究的重金属存在显著差异，相关研究仍相对不足。
斑马鱼（Danio rerio）幼鱼和大型蚤（Daphnia magna）是生态毒理学研究中广泛使用的模式生物，两者均具有快速发育、身体透明和易于实验室维持等共同特征，非常适合毒性筛选和环境风险评估。然而，目前缺乏系统性的跨物种比较研究，特别是采用多终点行为表型组学方法对重金属和稀土元素进行大规模对比评估的研究。
二、研究目的与意义
本研究旨在系统性地比较17种重金属和16种稀土元素在斑马鱼幼鱼和大型蚤新生幼体中的急性和亚致死神经行为毒性。具体目标包括：确定并比较所测重金属和稀土元素的急性毒性（LC50值）；在标准化暴露浓度下，利用高分辨率多终点行为表型组学表征亚致死行为效应；通过主成分分析（PCA）和层次聚类等多元分析识别物种特异性和元素特异性行为反应模式。该整合方法能够表征物种和金属特异性的行为毒性特征，评估神经行为紊乱是否独立于致死性发生，并在脊椎动物和无脊椎动物模型之间比较毒性排序，从而将行为表型组学确立为金属污染物生态风险评估的敏感工具。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法开展研究：第一，急性毒性测试，分别参照OECD测试指南第236号（鱼类胚胎急性毒性试验）和第202号（大型蚤急性活动抑制试验），斑马鱼幼鱼暴露96小时、大型蚤暴露48小时，测定LC50值；第二，高通量自动化行为追踪系统（ZebraBox，ViewPoint Life Sciences）结合ViewPoint软件和idtracker.ai深度学习追踪系统，获取个体精确运动坐标；第三，多终点行为表型组学分析，涵盖13个行为终点，包括总移动距离、爆发运动次数、旋转次数、平均速度、平均角速度、蜿蜒度、游泳比例、趋触性、中央区域停留时间、快速运动时间、分形维数、熵和冻结时间；第四，多元统计分析方法，包括主成分分析（PCA）、层次聚类热图分析和Spearman等级相关分析。斑马鱼胚胎购自当地水族商店，大型蚤来自国立嘉义大学淡水生物资源中心。
四、研究结果
急性毒性测试结果：研究人员通过急性毒性试验比较了各种重金属和稀土元素对斑马鱼幼鱼和大型蚤的致死效应。大多数化合物呈现明显的S形剂量-反应曲线，表明死亡率随浓度增加而升高。曲线陡峭程度和水平位移的差异反映了毒性水平和物种敏感性的差异。值得注意的是，大型蚤对大多数测试化合物的敏感性高于斑马鱼幼鱼，凸显了急性毒性反应中明显的物种特异性差异。
斑马鱼幼鱼总移动距离结果：斑马鱼幼鱼在暗期比光期表现出更高的运动活性。重金属锑（Sb）、铬（Cr）以及稀土元素铈（Ce）、镝（Dy）和钬（Ho）在光期显著增加了总移动距离；暗期中，Sb、Cr和Dy也显著增加了总移动距离。多种稀土元素包括Ho、Dy、铥（Tm）、铒（Er）和镥（Lu）在光暗两期均诱导运动活性增加。
斑马鱼幼鱼爆发运动结果：光期阶段，大多数化合物诱导明显的多动爆发表型，爆发计数在重金属、轻稀土元素（LREEs）和重稀土元素（HREEs）中均增加，提示唤醒水平升高或刺激反应增强。少数元素如锌（Zn）和若干稀土元素降低了爆发活性。钴（Co）在光期持续抑制爆发运动。暗期阶段，行为反应转向普遍抑制，大多数化合物相比对照组降低了爆发计数。
斑马鱼幼鱼游泳方向结果：大多数稀土元素在光暗两期均诱导旋转次数持续增加，提示感觉运动协调的持续改变或焦虑样盘旋行为增强。相比之下，铝（Al）、Sb、Cr、Mn和钼（Mo）等若干重金属抑制了旋转活性。光期大多数重金属和稀土元素显著增加旋转次数；暗期旋转增加主要限于稀土元素处理组，特别是镧（La）、Ce、铽（Tb）、Dy和Tm。
斑马鱼幼鱼二维行为终点结果：运动分析显示以抑制为主的行为特征，多种重金属和大多数稀土元素显著降低幼鱼活性，表现为平均游泳速度下降、游泳和快速运动时间减少、冻结时间增加。探索行为方面，镍（Ni）独特地减少了中央区域停留时间并增加了趋触性，提示回避或焦虑样行为增强。运动方向方面，Zn和大多数稀土元素增加了角速度，部分重金属和稀土元素增加了蜿蜒度。运动复杂性方面，Ni和多种稀土元素显著降低了分形维数和熵，表明运动模式简化和适应性降低。
大型蚤总移动距离结果：大型蚤在光期比暗期表现出更高的运动活性。重金属Sb、Cr、Co、镓（Ga）、Fe和Mn在光暗两期均诱导运动活性增加。光期大多数重金属增加运动活性，而轻稀土元素和重稀土元素普遍降低活性。暗期大多数测试重金属显著增加总移动距离，而所有测试稀土元素均显著降低运动活性。
大型蚤爆发运动结果：大型蚤在重金属和稀土元素暴露后表现出整体抑制的爆发运动表型，与斑马鱼幼鱼频繁表现出的爆发活性增加形成鲜明对比。光期仅少数重金属如Fe和锂（Li）诱导爆发活性增加，大多数其他重金属和所有稀土元素显著降低爆发计数。暗期Fe仍是唯一持续增加爆发活性的重金属。
大型蚤游泳方向结果：若干重金属包括Sb、Mn、Mo、Ni和Zn在光暗两期均持续增加旋转次数。相比之下，稀土元素表现出均匀的低旋转次数，数值接近零且变异性极小，表明对旋转行为影响甚微。
大型蚤二维行为终点结果：与斑马鱼幼鱼不同，大型蚤在重金属和稀土元素暴露后表现出以抑制为主的独特行为特征。运动分析显示仅有限数量的元素诱导显著效应：锶（Sr）降低平均游泳速度和游泳持续时间并增加冻结行为；铕（Eu）、Tm和钇（Y）同样抑制游泳活性并增加冻结时间；Mn和Zn选择性减少快速运动时间。探索行为、运动方向和运动复杂性参数均未显示与对照组的显著差异。
PCA与聚类结果：斑马鱼幼鱼的前两个主成分解释了总方差的63.1%，表明金属诱导的行为改变是结构化且非随机的。多种稀土元素如Ho、Dy、Eu、Tm和镱（Yb）与高干扰性重金属紧密聚类，反映共享的行为特征。大型蚤的PCA解释了57.3%的方差，大多数稀土元素在对照条件附近紧密聚类，表明行为效应较弱或维度较少。热图层次聚类显示大型蚤的毒性模式主要由基础运动终点驱动。
毒性排序与跨物种敏感性比较：综合毒性排序指数显示，许多显著扰乱斑马鱼幼鱼行为的重金属和稀土元素对大型蚤影响较小，反之亦然。例如铈（Ce）对幼鱼毒性高但对大型蚤效应较弱，而Mo对大型蚤毒性更高。Spearman等级相关分析显示两物种间毒性排序相关性极低（r = ?0.0337，p = 0.8521），表明毒性特征跨物种存在差异。
五、讨论与结论
讨论部分指出，重金属在斑马鱼和大型蚤中通常比稀土元素诱导更严重的毒性效应，这与重金属较高的生物可利用性和已确立的神经毒性机制一致。稀土元素虽能诱导可测量的行为改变，但效应强度较低且跨终点一致性较差。两物种间的行为反应差异——斑马鱼幼鱼倾向于在重金属暴露下表现多动，而大型蚤更多表现低活动性——可能源于神经生理学和生态适应的根本差异。重金属和稀土元素可能通过不同的毒理学途径发挥作用：重金属通过干扰离子稳态、神经传递和线粒体功能，而稀土元素可能通过干扰钙依赖性信号通路、改变膜通透性或间接干扰代谢。
研究结论表明，通过整合LC50急性毒性与统一亚致死浓度（0.1 mg/L）下13个高分辨率运动和探索终点，研究人员揭示了仅从死亡率数据无法显现的毒性模式。多种稀土元素包括Dy、Ho、Eu、Tm和Yb在斑马鱼幼鱼中诱导了显著的行为改变，效应幅度与多种重金属相当或超过后者。斑马鱼幼鱼在运动、方向和复杂性终点上表现出广泛且一致的行为敏感性，而大型蚤表现出较窄且以抑制为主的行为反应。两物种间行为毒性排序无显著相关性，且行为毒性排序与LC50值不一致，证明亚致死神经行为紊乱独立于急性致死性发生。这些结果确立了多终点行为表型组学作为金属风险评估的敏感且具区分力的方法，并强调了在评估重金属和稀土元素污染时纳入脊椎动物和无脊椎动物模型的生态学意义。
