川芎嗪联合青藤碱通过恢复脊髓背角代谢稳态缓解CCI诱导大鼠神经病理性疼痛中枢敏化

《Metabolites》：Ligustrazine Combined with Sinomenine Alleviates Central Sensitization in CCI-Induced Neuropathic Pain in Rats by Restoring Metabolic Homeostasis in the Spinal Dorsal Horn

　　

背景：神经病理性疼痛（NP）是由躯体感觉神经系统损伤或疾病引起的慢性疼痛状态。其发生和持续与外周伤害性输入、中枢敏化、神经免疫失调以及局部代谢微环境重塑密切相关。研究人员既往研究显示，川芎嗪与青藤碱联合治疗可改善慢性压迫性损伤（CCI）大鼠早期坐骨神经病理损伤和全身代谢紊乱。然而，该联合方案是否调节NP中的中枢敏化仍不清楚。目的：本研究旨在评价川芎嗪联合青藤碱治疗对CCI诱导神经病理性疼痛维持期疼痛相关行为和运动功能的影响，并探讨其减轻中枢敏化的潜在机制，尤其关注脊髓背角中的代谢重塑、神经递质稳态及相关调节分子。方法：建立CCI大鼠模型，动物接受川芎嗪联合青藤碱（12.5 + 12.5、25 + 25或50 + 50 mg/kg）连续7天治疗。评估机械缩足阈值、冷超敏和步态行为。采用多重检测分析12种血浆炎症细胞因子和疼痛相关介质。随后对脊髓背角进行整合转录组学和代谢组学分析，以识别关键改变通路。进一步进行氧化脂质（oxylipin）谱分析、靶向神经递质分析以及与精氨酸–多胺通路相关代谢物定量，以表征与中枢敏化相关的局部代谢微环境改变。最后，采用定量实时PCR（qRT-PCR）和Western blotting评估与多胺代谢、氧化还原稳态和中枢敏化相关的分子。结果：川芎嗪联合青藤碱治疗改善CCI大鼠疼痛相关行为和步态功能障碍，并部分纠正全身炎症失调。同侧/对侧最大接触面积比从Sham组的102.8 ± 9.0%降至Model组的53.1 ± 9.7%，并在高剂量组恢复至85.5 ± 4.4%。代谢组学和转录组学分析分别鉴定出治疗后54种差异代谢物和130个差异表达基因。整合多组学分析突出精氨酸相关代谢通路，同时涉及神经递质、多胺、氧化脂质和氧化还原稳态改变。

论文主体内容解读

研究背景：神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是由躯体感觉神经系统损伤或疾病引起的慢性疼痛，表现为自发痛、痛觉过敏和异常疼痛。其发生和持续与外周伤害性输入、中枢敏化、神经免疫失调及局部代谢微环境重塑相关。慢性压迫性损伤（chronic constriction injury, CCI）是研究NP的经典模型。外周神经损伤后，损伤神经及微环境出现炎症、免疫细胞激活、感觉神经元兴奋性增加，持续异常输入至脊髓背角，引起神经元超兴奋、胶质激活、突触传递异常和神经免疫相互作用失调，导致中枢敏化。神经递质稳态破坏、氧化应激和局部代谢微环境重塑也与NP发病相关。精氨酸代谢和氧化还原失衡可能是神经炎症、代谢重塑和中枢敏化的机制联系。精氨酸可经鸟氨酸通路生成多胺（polyamine），如腐胺（putrescine）、亚精胺（spermidine）和精胺（spermine），参与离子通道、NMDA（N-methyl-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受体、炎症和氧化应激调节。SLC7A11/xCT是system x_c^?关键轻链亚基，介导胱氨酸摄取和谷氨酸外排，为谷胱甘肽合成供底物并影响兴奋性传递。川芎嗪和青藤碱在东亚传统医学中用于疼痛，具抗炎、抗氧化、免疫调节、镇痛和神经保护等多通路作用。研究人员既往研究显示联合治疗在多种外周和中枢NP模型有镇痛效应，并改善CCI大鼠机械和冷超敏、坐骨神经病理和炎症，网络药理学和代谢组学提示炎症、氨基酸代谢和神经递质通路。然而，联合治疗能否恢复脊髓背角代谢稳态并调节NP相关中枢机制尚待阐明。因此，研究人员开展本研究，评价7天联合治疗对CCI大鼠疼痛行为、步态和全身炎症影响，并整合多组学探讨中枢机制。

关键技术方法：研究采用SPF级雄性Sprague–Dawley大鼠（6–7周龄，180–220 g，北京HFK Bioscience Co., Ltd.，生产许可SCXK[北京]2024-0003；伦理批号ERCCACMS21-2111-01）建立CCI模型，设Sham、Model、LGZ+SIN低/中/高剂量和Pgb组，灌胃每日两次连续7天。主要技术包括von Frey纤维测机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold, MWT）、丙酮试验测冷超敏、啮齿类步态分析；血浆RayPlex?多重珠法检测炎症细胞因子和疼痛相关介质；脊髓背角广泛靶向代谢组LC–MS/MS、RNA-seq转录组（mRatBN7.2）及MetaboAnalyst 6.0整合；oxylipin靶向LC–MS/MS；苯甲酰氯衍生化靶向神经递质LC–MS/MS；精氨酸–多胺和氧化还原指标LC–MS/MS；qRT-PCR和Western blotting检测SAT1、SLC7A11/xCT、GRIN2B/NR2B。

研究结果：
3.1 川芎嗪联合青藤碱改善CCI大鼠疼痛相关行为和步态功能障碍。3.1.1 联合治疗提高机械缩足阈值并减轻冷超敏：von Frey和丙酮试验显示，模型组MWT降低、冷超敏评分升高；中剂量第7天显著提高MWT，冷超敏有下降趋势但未达显著。3.1.2 联合治疗改善同侧后爪承重和步态对称性：步态分析显示模型组同侧/对侧最大接触面积比降至53.1 ± 9.7%，高剂量恢复至85.5 ± 4.4%；高剂量广泛改善站立、支撑和摆动参数，Pgb也改善但部分参数不如高剂量。

3.2 联合治疗调节CCI大鼠全身炎症失调。血浆多重检测显示模型组IL-17、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-1β升高，Eotaxin-1、IL-4、IL-10、KC、IL-13降低；联合治疗部分恢复，低剂量调节促炎和免疫调节介质，中剂量对IL-17、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-13等调节较广。

3.3 联合治疗重塑脊髓背角转录组和代谢组谱。3.3.1 全局代谢组变化和差异代谢物筛选：广泛靶向代谢组PCA和OPLS-DA显示组间分离；模型vs Sham鉴定35种差异代谢物，LGZ+SIN vs Model鉴定54种，交集6种。3.3.2 调节转录组谱和DEG功能特征：RNA-seq显示模型vs Sham有659个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），LGZ+SIN vs Model有130个，交集34个；KEGG/GO提示嘌呤/核苷酸代谢、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、钙信号、细胞因子受体、过氧化物酶体、抗原加工递呈等。3.3.3 整合转录组和代谢组揭示精氨酸相关代谢网络改变：联合通路分析突出精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成，匹配NOS1、N-乙酰-L-谷氨酸、腐胺、精胺和GABA。

3.4 联合治疗改善CCI大鼠脊髓背角oxylipin代谢紊乱。3.4.1 定量oxylipin分析和差异oxylipin筛选：靶向172种分析物，检测49种多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）及oxylipin，鉴定11种差异oxylipin；自建数据库比KEGG多识别3条富集通路。3.4.2 CCI诱导DHA、EPA、AA相关oxylipin代谢改变：模型组二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）降低、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）升高，DHA衍生物(±)-20-HDoHE和EPA衍生物19(20)-EpDPE异常升高。3.4.3 联合治疗恢复关键DHA/EPA相关oxylipin改变：联合治疗降低上述两种oxylipin，DHA/EPA前体呈正常化趋势。

3.5 联合治疗调节脊髓背角神经递质代谢稳态。3.5.1 靶向神经递质代谢谱全局变化和通路富集：PCA/OPLS-DA显示高剂量趋近Sham；KEGG富集以色氨酸和酪氨酸代谢等为主。3.5.2 改善谷氨酸代谢失衡并调节异常GRIN2B/NR2B表达：模型组谷氨酸（glutamate, Glu）升高、谷氨酰胺（glutamine, Gln）无显著变化，GRIN2B mRNA降低而NR2B蛋白升高；高剂量降低Glu，联合降低NR2B蛋白。3.5.3 调节色氨酸–血清素/犬尿氨酸轴：模型组5-HTP、5-HT、5-HTOL、犬尿氨酸（kynurenine, Kyn）、TrpA降低；联合各剂量升高5-HT，高剂量升高5-HTP和Kyn。3.5.4 调节苯丙氨酸–酪氨酸–儿茶酚胺轴：模型组多巴胺（dopamine, DA）、去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）降低，3-甲氧酪胺（3-methoxytyramine, 3-MT）、高香草酸（homovanillic acid, HVA）升高；联合降低3-MT、HVA，但DA、NE未显著恢复。3.5.5 改善单胺神经递质周转和犬尿氨酸通路稳态：模型组3-MT/DA、(DOPAC+HVA)/DA、HVA/DA、Mel/5-HT、NAS/5-HT升高，Gln/Glu降低，QA/Kyn升高、Kyn/Trp降低；联合降低3-MT/DA和(DOPAC+HVA)/DA，高剂量降低HVA/DA、NAS/5-HT并升高Gln/Glu，中高剂量降低QA/Kyn，高剂量升高Kyn/Trp。

3.6 联合治疗调节脊髓背角精氨酸–多胺代谢和氧化还原稳态。3.6.1 改善精氨酸–多胺代谢紊乱并调节SAT1表达：模型组L-鸟氨酸和精胺升高，N¹-乙酰精胺及N¹-乙酰精胺/精胺降低，SAT1 mRNA和蛋白升高；联合降低L-鸟氨酸和精胺，恢复N¹-乙酰精胺及比值，调节SAT1表达。3.6.2 改善氧化还原代谢失衡并调节xCT表达：模型组NADPH和GSSG升高，NADP/NADPH和cystine/cysteine降低，SLC7A11 mRNA降低而xCT蛋白升高；联合降低NADPH和GSSG，升高NADP/NADPH和cystine/cysteine，剂量相关降低xCT蛋白。

讨论总结：CCI模型复现持续痛和运动功能障碍，联合治疗改善行为与步态，高剂量最明显，与既往一致。NP持续与脊髓背角局部代谢微环境重塑相关。整合组学显示精氨酸/脯氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸代谢是CCI病理与药理干预汇聚点。Oxylipin参与炎症、血管、免疫和炎症消退，CCI扰乱DHA/EPA/AA/LA/ALA通路，联合降低关键ω-3 PUFA衍生物。神经递质方面，CCI抑制色氨酸–5-HT/犬尿氨酸/吲哚轴并降低DA/NE、增加多巴胺代谢产物，联合恢复5-HT、部分犬尿氨酸平衡并降低多巴胺周转。Glu升高、Gln/Glu降低及NR2B蛋白异常提示谷氨酸能兴奋和NMDA受体相关中枢敏化，联合降低Glu和NR2B。精氨酸–多胺和氧化还原异常（SAT1、N¹-乙酰精胺/精胺、NADP/NADPH、GSSG、cystine/cysteine、xCT）在治疗后部分恢复，提示多代谢网络协调调节。

研究结论翻译：总之，本研究证明，川芎嗪联合青藤碱治疗通过恢复脊髓背角代谢稳态减轻CCI诱导的神经病理性疼痛和中枢敏化。整合转录组学和代谢组学分析显示，LGZ + SIN的治疗效应与多个代谢网络协调调节相关，包括精氨酸–多胺代谢、神经递质稳态、oxylipin代谢和氧化还原平衡。这些代谢改变伴随炎症谱改善、氧化应激降低以及疼痛相关信号通路调节，包括xCT/NR2B相关轴。总体而言，研究人员的发现为川芎嗪联合青藤碱镇痛效应的多维机制提供了新见解，并强调脊髓代谢重塑是神经病理性疼痛的潜在治疗靶点。