浑浊介质中异质生物制剂的扩散反射动力学分析：标准方法的局限性及概念验证评估

《Analytica》：Analysis of Heterogeneous Biological Preparations in Turbid Media: Limitations of Standard Methods and a Proof-of-Concept Evaluation of Diffuse Reflectance Kinetics

　　

： （1）背景：浑浊生物制剂对常规光学蛋白质分析构成挑战，因为散射和颗粒异质性可能扭曲分析信号。（2）方法：本研究评估了紫外-可见光谱法（UV-Vis spectroscopy）、内源荧光法（intrinsic fluorescence）和动态光散射法（dynamic light scattering，DLS）在含蛋白质异质体系中的局限性，并探索了扩散反射动力学（diffuse reflectance kinetics，DRK）作为一种非破坏性补充方法的可行性。研究采用含和不含颗粒组分的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）模型体系来评估基质相关效应，同时以角鲨烯佐剂病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）制剂作为代表性浑浊生物制药体系进行研究。DRK分析基于时间分辨的漫反射图像序列以及时空散射动力学的数值描述符。（3）结果：常规光学方法受浑浊度影响显著，而选定的DRK描述符在含角鲨烯乳液基质中表现出浓度依赖性响应，并在所研究的条件下显示出可接受的重现性。结果支持DRK在浑浊生物制剂中用于表观蛋白质相关变化比较监测的潜力。（4）结论：在DRK可被视为定量蛋白质测定方法之前，需要使用独立的最终疫苗批次和正交参考方法进行进一步验证。

论文解读文章：

一、研究背景与问题

生物制药分析面临重大挑战，这源于现代免疫生物制品中分子的复杂性以及严格的监管要求。根据世界卫生组织（WHO）在《生物制品良好生产规范》（GMP）附件2中发布的声明，生物制品是具有显著异质性的复杂系统，尽管在药品质量体系（PQS）和质量风险管理（QRM）框架下持续监管，但使用标准理化方法仍难以对其进行分析。现有方法在描述复杂、多组分和结构化系统时往往力不从心，可能对凝聚态介质的结构和动态表征引入系统性偏差。

下一代疫苗，特别是病毒样颗粒（VLP）疫苗，是典型的异质生物制品。VLP是由病毒衣壳蛋白自组装形成的生物纳米颗粒，不含病毒基因组，无复制活性，尺寸通常在20–200 nm范围内。VLP疫苗能够模拟天然病毒粒子的几何结构、多价性和大小，从而有效运输至淋巴结并引发强烈免疫应答。然而，VLP疫苗制剂中除抗原蛋白外还含有佐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液和防腐剂等多种辅料，这些组分与VLP本身共同造成了颗粒尺寸大、结构复杂和浑浊度高等分析困难。

在蛋白质定量方面，疫苗制剂中抗原剂量通常以每剂蛋白质微克数表示，该参数是贯穿开发和制造全过程的关键质量属性（CQA）。然而，常规蛋白质测定方法如紫外-可见光谱法、BCA法（二喹啉甲酸法）和Bradford法（考马斯亮蓝法）在直接应用于浑浊疫苗制剂时，可能因多重散射、吸收和背景贡献而出现准确性下降、稳健性受限和方法依赖性偏差。因此，开发能够直接从光学异质系统中提取定量信息的分析方法成为当务之急。

二、研究内容与意义

本研究旨在探索扩散反射动力学（DRK）作为一种补充性、非破坏性分析方法，用于浑浊生物基质中蛋白质相关响应的探索性评估。研究以BSA模型系统和佐剂化VLP疫苗制剂为对象，具体目标包括：表征浑浊度和大型散射颗粒对常规光谱和分散测量的限制；评估多步纯化对VLP制剂分散特性和光学适用性的影响；考察DRK描述符在模型乳液基质中的浓度依赖性响应；确定最适合探索性校准的描述符；以及初步评估BSA加标VLP疫苗制剂中的基质相关效应。

研究结果表明，常规光学方法在浑浊介质中受到显著影响，而DRK描述符d2在含角鲨烯乳液基质中表现出最一致的浓度依赖性响应，线性回归模型显示强正相关（Pearson's r = 0.99710，R2 = 0.99421），日内重复性变异系数为1.13%。在VLP疫苗制剂中的初步加标回收实验获得平均表观回收率94.8%。这些发现支持DRK在浑浊生物基质中直接进行蛋白质相关响应初步评估的可行性。

三、主要技术方法

研究采用的主要技术方法包括：紫外-可见吸收光谱法（UV-Vis spectroscopy）用于记录BSA溶液在200–400 nm波长范围的吸收光谱；内源荧光光谱法（fluorescence spectroscopy）在280 nm激发波长下记录色氨酸发射光谱；动态光散射法（DLS）使用Zetasizer 3000仪器评估颗粒尺寸分布和分散特性；透射电子显微镜（TEM）用于观察VLP形态；扩散反射动力学（DRK）方法基于高亮度LED光源（波长约810 nm）照射样品表面，通过USB显微镜以30帧/秒的帧率连续采集60秒图像序列（每测量1800帧），随后使用Vidan?软件计算十个拓扑描述符（TDs）。样品为BSA模型体系（含或不含硫酸盐乳胶微球模拟浑浊度）和角鲨烯佐剂VLP疫苗制剂（声明抗原蛋白浓度160 μg/mL，即每0.5 mL剂量含80 μg）。

四、研究结果

4.1 浑浊异质生物溶液的光谱和分散特性——观察到的局限性

研究通过BSA模型体系系统考察了浑浊介质对常规光学方法的影响。在透明TBS缓冲液中，BSA溶液的紫外吸收-浓度关系呈良好线性（Pearson's r = 0.99928），而在添加硫酸盐乳胶微球模拟浑浊度后，线性相关系数降至0.98112，表明光散射和光学异质性对吸收测量的贡献。内源荧光测量中，浑浊条件对线性关系的破坏更为严重，相关系数从均匀介质中的0.99960骤降至浑浊介质中的0.22220。DLS测量同样显示，添加乳胶微球后，原本均匀的BSA溶液出现了显著的微米级强度贡献，表明少量大颗粒或聚集体可不成比例地主导散射信号。这些结果共同表明，从透明溶液到浑浊悬浮液的转变显著影响了光学测量的可靠性。

4.2 佐剂疫苗的分散特性

对含VLP的培养上清液进行DLS分析显示，纯化前样品呈强烈的多分散和多模态分布，与细胞碎片、聚集体和其他光学不均匀组分的存在一致。经过离心分层、核酸酶处理、沉淀重悬和膜过滤四个关键纯化阶段后，样品呈现以纳米级群体为主的单模态分布，平均流体动力学直径为37 ± 6 nm，多分散指数（PDI）为0.12，Zeta电位为?29.5 ± 0.9 mV，表明静电稳定性良好。TEM显微照片证实了与病毒样结构一致的单个纳米颗粒形态，与DLS数据相符。这些结果表明多步纯化有效降低了多分散性和粗颗粒杂质的贡献。

4.3 DRK用于浑浊介质生物制剂分析的概念验证评估

4.3.1 漫反射模型与描述符提取

DRK方法基于监测浑浊生物系统表面漫反射光的时间依赖性动态，然后处理散斑图像序列。与单一终点反射光强度测量不同，该方法考虑了散射光空间分布的时间变化。光子输运采用外推边界扩散模型进行概念描述。通过将初始图像逐像素减去后续图像，突出散射光相对于初始状态的变化，并将得到的差分图像转换为表征散射光分布时空动态的数值描述符。

4.3.2 基质相关效应评估与DRK方法探索性校准

研究将BSA以60、120、180、240和360 μg/mL五个浓度水平添加到含角鲨烯的TBS基乳液基质中，比较了十个DRK描述符对BSA添加的响应。结果显示，d1和d3描述符呈现非单调行为，sd1、sd2和sd3描述符相对空白基质显著降低，而r1、r2、r3和R描述符总体增加但伴随较大变异性。其中d2描述符表现出最一致的浓度依赖性行为，平均响应从60 μg/mL时的7.860增加至360 μg/mL时的8.491，相对于空白基质的增幅约为1.2–9.3%。d2因此被选为探索性校准的主要响应变量。拟合的线性回归模型为d2 = 7.73306 + 0.00211C，Pearson's r = 0.99710，R2 = 0.99421。在180 μg/mL名义BSA浓度下进行的六次日内重复性测量显示，d2值范围为8.19至8.41，平均响应为8.31 ± 0.094，变异系数为1.13%，表明低日内变异性。此外，七个匹配VLP制剂的DRK表观BSA等效蛋白浓度与Pierce BCA蛋白测定试剂盒结果进行了比较，BCA平均浓度为179.43 μg/mL（CV = 0.44%），DRK平均浓度为179.14 μg/mL（CV = 1.31%），两种方法结果接近。

4.3.3 VLP疫苗制剂中基质效应的初步评估

为初步评估真实疫苗制剂中的基质效应，研究人员将含80 μg VLP蛋白（名义浓度160 μg/mL）的VLP疫苗制剂与含260 μg BSA的溶液（浓度520 μg/mL）等体积混合，最终体积1.0 mL，名义总蛋白浓度340 μg/mL。三个独立制备样品的d2响应经校准方程换算后，表观等效浓度分别为311、316和340 μg/mL，对应表观回收率为91.5%、92.9%和100.0%，平均回收率94.8%。结果表明VLP疫苗基质在所研究条件下未对DRK响应产生显著负偏差。

五、结论与讨论

研究结论指出，浑浊生物制剂中的光学测量受到浑浊度、多重光散射和少量大散射颗粒存在的显著影响。在BSA模型体系中，这些效应降低了紫外吸收和荧光响应的线性度，并明显扭曲了DLS获得的粒径分布。VLP制剂的多步纯化显著降低了多分散性和粗颗粒杂质贡献，表现为DLS分布变窄、低PDI、负Zeta电位和TEM观察结果。然而，基质相关效应在纯化生物制剂的分析中仍然存在。DRK方法通过分析漫反射光的时间演化而非仅依赖单一终点光学信号，有助于解决这一局限。在研究的描述符中，d2在含BSA乳液基质中表现出最一致的浓度依赖性响应，因此被选为探索性校准的响应变量。d2模型与BSA浓度呈强关联（r = 0.99710，R2 = 0.99421），日内重复性变异系数为1.13%。VLP疫苗制剂中的初步加标回收实验获得平均表观回收率94.8%。

研究同时指出当前验证的局限性：重复性测试仅限于单日，VLP基质中加标回收实验仅在单一名义浓度下进行，且DRK尚未与已建立的蛋白质定量方法（如BCA、Bradford和Lowry法）或基于澄清处理的基质匹配校正方法进行直接对比。DRK相对于标准方法在准确性、精密度、选择性和通量方面的实际优势仍需通过多日、多水平和头对头比较研究来确定。

总体而言，研究结果支持DRK用于浑浊生物基质中蛋白质相关响应的初步评估，展示了该方法在表征异质生物制剂方面补充常规分析方法的潜力，特别是在残余浑浊度和光散射限制直接光学测量可靠性的情况下。下一步方法开发应聚焦于日间（多日）重复性评估、跨多个加标水平的基质匹配校准、扩展研究浓度范围、与已建立蛋白质测定方法的直接比较，以及系统表征校准模型充分性、残差行为、准确性、精密度、选择性和回收率。