《Cell Genomics》：Single-cell multiomics across nine mammals reveals cell-type-specific regulatory conservation in the brain
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理解大脑中的基因调控对于定义神经系统疾病的遗传基础至关重要。顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）调控基因表达，但其功能与进化取决于序列以及顺式和反式调控环境。研究人员从九个哺乳动物物种的大脑皮层生成了单核RNA测序（sin
理解大脑中的基因调控对于定义神经系统疾病的遗传基础至关重要。顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）调控基因表达，但其功能与进化取决于序列以及顺式和反式调控环境。研究人员从九个哺乳动物物种的大脑皮层生成了单核RNA测序（single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq）和单核ATAC测序（single-nucleus ATAC-seq, snATAC-seq）数据，并鉴定了细胞类型特异的候选CREs（candidate CREs, cCREs）。研究人员开发了一个整合序列、染色质可及性和增强子-基因关联的多维保守性框架。大规模并行报告分析（massively parallel reporter assays, MPRAs）在人类神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）和神经元中测量了保守及人类特异性CREs的活性，而CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）验证了包括FAM181B在内的保守位点处的增强子功能。基序富集分析鉴定了区分保守CREs与进化CREs的转录因子。连锁不平衡评分回归（linkage disequilibrium score regression, LDSC）显示，保守和人类特异性CREs富集了神经精神疾病的全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）风险，而神经退行性疾病风险仅限于保守元件。这些发现定义了增强子保守性的功能维度，并揭示了调控进化如何塑造大脑生物学和疾病易感性。
**研究背景与科学问题**
大脑的复杂功能依赖于精确的基因表达调控，而顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）在定义神经系统疾病的遗传基础中起关键作用。CREs的功能和进化不仅取决于其自身序列，还受到顺式和反式调控环境的影响。现有基于序列保守性的比较基因组学方法（如Zoonomia）虽已鉴定大量保守和谱系特异的候选CREs（candidate CREs, cCREs），但无法捕捉细胞类型特异的调控活性和功能保守性，尤其难以解析大脑中高度多样的细胞类型。序列保守与功能保守并不总是一致：分歧序列可能保留活性，而保守序列在特定环境中可能无功能。因此，需要整合多维度的功能信息来系统评估CREs的保守性及其与疾病风险的关系。研究人员构建了跨九个哺乳动物物种的单细胞多组学图谱，以解析细胞类型特异的调控保守性，并探讨调控进化如何影响大脑生物学和疾病易感性。
**研究内容与结论**
研究人员对九个哺乳动物（人、小鼠、猕猴、狨猴、大鼠、猫、兔、马、牛）的大脑皮层以及斑马鱼端脑进行了单核多组学分析（snRNA-seq和snATAC-seq），独立注释了八种主要细胞类型，并整合跨物种数据。通过将各物种的snATAC-seq峰liftOver至人类基因组，根据峰在不同物种中的存在情况定义了调控保守性等级（R1–R4及R0），并依据可映射性定义了序列保守性等级（S1–S4）。研究人员预测了cCRE-基因关联并划分靶基因保守性等级（T1–T4及T0）。结合MPRA、CRISPRi、转录因子（transcription factor, TF）基序分析、染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq）和LDSC等实验与计算方法，系统评估了CREs的功能、进化与疾病意义。研究发现：（1）调控保守性与序列保守性部分分离，深度保守的R4元素富集于斑马鱼可及区域，而人类特异性R1元素富集于小胶质细胞特异cCREs；（2）细胞类型特异的染色质可及性模式在哺乳动物间大体保守，但小胶质细胞和兴奋性神经元呈现谱系特异的进化创新；（3）许多cCRE-基因关联在物种间发生重连，例如FOS位点存在人类特异的小胶质细胞增强子-基因关联；（4）TF基序分析揭示保守的神经元调控语法（如MEF2家族），而CREB1和REST倾向于结合近期进化的cCREs，并参与神经免疫和突触相关通路；（5）MPRA证明近期进化的人类cCREs可具有与保守元件相当的增强子活性，而人类缺失的R0元件在人类细胞中活性较低；（6）CRISPRi验证了多个深度保守增强子的功能，如FAM181B增强子扰动可下调其表达；（7）鉴定出1,091个人类丢失（human-lost, HL）cCREs，富集于神经元特异调控，且携带可能破坏TF结合的人类衍生等位基因；（8）LDSC显示阿尔茨海默病遗传力富集于保守小胶质细胞cCREs，而精神分裂症、双相情感障碍和神经质在保守及近期进化cCREs中均有富集。
**关键方法**
研究人员使用10x Chromium单细胞多组学平台生成snRNA-seq和snATAC-seq数据，物种来源包括新产生的五种（大鼠、猫、兔、马、牛）及已发表的三种非人灵长类（猕猴、狨猴）和小鼠数据，并补充斑马鱼端脑数据。核心方法包括：跨物种峰liftOver和调控保守性分类；基于染色质可及性与基因表达相关性的cCRE-基因关联推断；tau指数定义细胞类型特异性；JASPAR基序富集和chromBPNet从头基序发现；MPRA在HEK293FT、NPCs和谷氨酸能神经元中检测增强子活性；CRISPRi在iPSC来源的BrainPhys神经培养中验证增强子-基因调控；LDSC进行遗传力分层分析；荧光素酶报告实验验证风险变异效应。
**研究结果**
**单细胞多组学图谱覆盖九个哺乳动物**：整合分析共获得725,776个峰，平均每物种217,501个，可注释出星形胶质细胞、内皮细胞、兴奋性神经元、抑制性神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞和血管周细胞八种主要细胞类型，UMAP显示可及性图谱主要按细胞类型聚类。
**cCREs的调控保守性**：人类中共检测到213,687个峰，其中150,078个（R3）与至少一种非灵长类哺乳动物共享，16,427个（R1）为人类特异性。R4深度保守元素显著富集于斑马鱼可及区（OR=5.32），而R1/R2元素富集转座子衍生序列。调控保守性高的cCREs整体序列保守性更高，但许多跨物种共享的cCREs并未表现出高序列保守性，提示功能测量的必要性。
**cCREs细胞类型特异性的保守性**：tau指数显示细胞类型特异峰在跨物种中保持选择性可及性模式。小胶质细胞特异cCREs在人类特异性R1中显著富集（OR=3.19），而兴奋性神经元特异cCREs在灵长类共享R2中富集，多细胞类型共享峰则多见于深度保守R4。
**基因靶标的保守性**：共预测358,508个cCRE-基因关联（人类75,977个）。人类特异性T1关联占36.9%，但需谨慎解释；深度保守的R4–T4关联富集启动子样序列，且距转录起始位点更近。增强子序列保守性与靶基因约束（RVIS）的关联在T4保守关联中更强（β=0.047, p=0.0036）。FOS位点显示，四个人类特异的小胶质细胞cCRE-FOS关联实际位于跨物种保守的cCRE内，提示增强子-启动子连接在人类中被重连。
**跨进化的TF基序语法**：基序富集分析鉴定出微胶质模块（SPI1、RUNX1）、保守模块（YY1、CTCF、SP1）和神经元模块（PKNOX1、SOX3、RFX3及FOS、MEF2C等）。chromBPNet从头基序发现显示MEF2家族在四物种中均为高频检出。ChIP-seq数据显示CREB1偏好结合近期进化神经元cCREs，REST偏好结合近期进化微胶质cCREs，且其关联基因分别富集突触传递和炎症反应通路。
**神经元cCRE活性**：MPRA测试750个兴奋性神经元相关cCREs，发现约50%在HEK293FT、NPC和神经元中均有活性。近期进化R1/R2 cCREs活性与保守R4相当，而R0非人类cCREs在人类细胞中活性显著较低。NPC特异活性cCREs关联mRNA剪接、轴突发生等通路，神经元特异活性cCREs关联内吞回收、PI3K/AKT信号等通路。
**保守增强子-基因关联验证**：CRISPRi靶向14个深度保守神经元增强子和17个启动子，15个区域导致至少一个200 kb内基因显著下调，包括FAM181B。针对FAM181B增强子的扰动显著下调FAM181B（log2FC=?1.36, adjusted p=0.049），而T0关联的PRCP未改变，验证了保守增强子对靶基因的特异性调控。
**人类丢失的CREs**：鉴定出1,091个HL cCREs，在所有非人类哺乳动物中可及但在人类中无可及性或TF结合。HL cCREs显著富集于兴奋性和抑制性神经元特异cCREs，并富集HARs（OR=5.07）和hCONDELs（OR=3.52）重叠。73%的HL中人类衍生等位基因预测破坏TF基序。SRGAP2关联最多（9个HL cCREs），提示调控丢失可能与人脑进化相关。
**功能保守性分层疾病遗传力**：LDSC显示AD遗传力富集于保守微胶质cCREs（R3/T3），而精神分裂症、双相情感障碍和神经质在神经元cCREs中跨多种保守性均显著。自闭症遗传力富集于R3但T1的cCREs。等位基因频率分析显示AD风险变异在R1微胶质cCREs中频率较高，而精神分裂症风险变异在R1兴奋性cCREs中频率较低。荧光素酶实验表明，精神分裂症相关变异rs3823381（灵长类特异R2）降低增强子活性，rs324017（保守R3）增加增强子活性。
**讨论与结论**：研究人员建立的多维保守性框架表明，保守调控程序倾向于维持序列、活性和增强子-基因连接，而进化创新可通过序列变化、CRE活性获得/丢失或连接重连产生。FOS调控的重连和HL cCREs支持“越少越好”的进化假说。AD遗传力集中于保守微胶质元件，而精神疾病风险同时涉及近期进化和保守神经元元件，说明不同进化层次的调控扰动共同影响疾病易感性。结论翻译：该研究通过整合序列保守性、染色质可及性、细胞类型特异性和预测靶基因保守性，扩展并细化了对大脑调控保守性的理解，为探讨调控保守性和创新如何塑造人脑基因调控以及疾病风险提供了框架和资源。
