# 温度与资源可利用性调控海洋及土壤细菌分离株的异养无机碳固定

《Applied and Environmental Microbiology》：Heterotrophic inorganic carbon fixation varies with temperature and resource availability in marine and soil bacterial isolates

　　

无机碳在细胞代谢中的利用是所有生物体的普遍特征。通过异养无机碳固定（heterotrophic inorganic carbon fixation, HICF）将无机碳同化为生物量，被估计对全球碳固定有显著贡献，然而，在严格异养微生物中调控这一过程的因素仍较为有限。为识别HICF的潜在驱动因子，研究人员在两种温度（最适温度与较冷温度）和资源处理（高有机碳与低有机碳）条件下培养了特征明确的两株异养γ-变形菌（Gammaproteobacteria）——恶臭假单胞菌（*iPseudomonas putida/i*）和卡拉胶交替假单胞菌（*iPseudoalteromonas carrageenovora/i*），所有培养物均添加NaH¹³CO₃。研究人员进行了样品整体（bulk）和单细胞（single-cell）稳定碳同位素探针（stable carbon isotope probing, SIP）分析，以检测和量化各条件下的HICF，并测定了其他代谢状态指标，包括碳氮比（C/N ratio）、自然丰度氮同位素比值以及细胞尺寸。研究发现，所有处理均观察到了HICF，其中*iP. putida/i*生物量源自¹³C-溶解无机碳（dissolved inorganic carbon, DIC）的比例为0.006%至0.029%，*iP. carrageenovora/i*为0.18%至1.1%，处于以往对回补（anaplerotic）固定对异养生物量贡献估算（1%至8%）的偏低端。HICF通常在指数生长期、最适生长温度以及低碳条件下最高，这些趋势在单细胞水平也得到了验证。总体而言，温度和资源可利用性对HICF速率有影响。这些发现表明，在环境中，当DIC和氮不受限制、而可被利用的有机碳通量受限或间歇性时，HICF可能更为重要。在此类环境系统中应用¹³C-DIC标记的稳定同位素探针技术，可能有助于记录异养微生物对群落碳固定的贡献。

**异养无机碳固定的环境调控：温度、资源可利用性与生长阶段的影响**

---

## 一、研究背景与科学问题

无机碳在细胞代谢中的利用是生命体的普遍现象。长期以来，异养微生物被定义为必须依靠有机碳才能存活的生物群，然而越来越多的证据表明，异养微生物同样能够通过一系列羧化反应将无机碳（如溶解无机碳DIC）固定到生物量中。这种通过回补机制（如回补代谢）将DIC融入生物量碳的过程称为异养无机碳固定（HICF）。据估计，每年通过HICF固定的DIC规模为0.34至12.3 Pg碳，其总量与光自养生物的年碳产量处于同一数量级。然而，尽管HICF在全球碳循环中具有潜在的重要地位，目前科学界对严格异养微生物中控制这一过程的生态与环境因素仍了解甚少。已有的研究结果存在明显矛盾：一些研究认为HICF底物刺激且仅发生在代谢活跃细胞，另一些研究则在细菌的环境稳定生长期观察到显著的13C-DIC吸收；部分海洋系统研究认为有机碳缺乏会促进HICF，其他研究则证明有机碳补充能刺激回补反应；温度这一环境变量对HICF的影响也尚不明确。这些不确定性严重制约了人们对暗碳固定（dark carbon fixation）研究中自养、混合营养与异养贡献的区分能力，也影响了稳定同位素探针研究对异养固碳的准确量化。

---

## 二、研究目的与关键科学假设

为厘清HICF的环境调控机制，研究人员设计了轴向批量培养实验，采用两株分属不同生态系统的典型严格异养γ-变形菌——来自土壤的*iPseudomonas putida/i* ATCC 17453和来自海洋的*iPseudoalteromonas carrageenovora/i* DSM 6820——作为实验对象。两种菌株均含磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC），且均属于在海洋和土壤环境中经常被发现参与DIC同化的Gammaproteobacteria类群。实验采用2×2因子设计：有机碳浓度（高碳/低碳）与培养温度（最适温度/较冷温度），所有处理均添加¹³C标记的NaHCO₃。需要说明的是，高碳与低碳处理组的底物碳氮磷比（C:N:P）分别为3,113:24:1和311:24:1，以诱导不同的养分限制条件。研究系统地探究了资源条件、温度和生长阶段如何共同影响HICF，并整合了元素组成（C/N比）、自然丰度氮同位素（δ¹⁵N）、细胞尺寸和单细胞碳同位素分析等多重观测角度来验证假设。

---

## 三、主要研究结果

### 3.1 *iP. carrageenovora/i* 的生长与元素组成变化

高有机碳培养物的生物量产量（最适温度ODmax=0.71，低温ODmax=0.66）显著高于低碳处理（最适温度ODmax=0.31，低温ODmax=0.23）。在高碳条件下，生物量碳氮比从指数期到稳定期增长了一倍以上（最高达13.4–15），细胞体积同步增大，呈氮或磷限制的典型特征；低碳条件下则见C/N比基本不变，细胞体积不增加且形态更趋圆形，符合碳限制诱导的细胞形态响应。

### 3.2 高碳条件下*i. carrageenovora/i*培养物的氮限制同位素证据

碳同位素分析确认了高碳条件确实应以氮限制为主而非磷限制。在指数期收获的*ip. carrageenovora/i*培养物相对预培养物在δ¹⁵N上呈贫化，与硝酸盐同化的动力分馏效应一致；进入稳定期后，δ¹⁵N值趋于一致并接近初始硝酸盐的δ¹⁵N值（~16.5‰），且重量百分氮（Wt%N）连续下降，这表明培养基中硝酸盐已完全被消耗同化——而低碳条件下δ¹⁵N的持续富集则说明硝酸盐并未被耗尽，属于碳限制系统。

### 3.3 *i. P. putida/i* 的生长与元素组成模式

高碳*i. putida/i*培养的ODmax（1.13，1.04）也高于低碳处理（0.27，0.24），细胞目均大于低碳条件。然而，与*i. carotegene/carrageenovora*/i*不同，*ip. put.*/i*的生物量C/N比在不同生长条件下变化不大（3.45–4.10），接近于胰蛋白胨本身（~3.5），表明T总碳但对*i. remn. put/idens*而言，有机物总也作为碳源利用。

### 3.4 *i. P. put. ida/i* 中资源分配的同位素证据

在*i（P. put.*/i*）中，尽管高碳和低碳处理的底物C/N比相同，δ¹⁵N值却出现了分化，表明细胞使用了不同的碳氮利用方案。当氨基酸（胰蛋白胨）被同时充当碳源和氮源时，细胞可能发生脱氨作用并优先释放¹⁴N，使残余生物量富集¹⁵N。低碳条件下观察到的更高δ¹⁵N值暗示胰蛋白胨降解供碳的比例更大，从而改变了细胞级碳氮预算。

### 3.5 两种菌株均表现异养固定¹³C-NaHCO₃

所有接种均有宿主培养概念可753行它不仅不受碳限制或无碳**遗传资源**和碳**每**基**经济策划组系统性无存在环境下个别名词及其基础条件和酶体系¹³，其偏好数据表明bud量同序后标注百分比最佳鑫阈值因子如7.4±2有全球关联，0.006–0.029%%（*iP. put*在）和0.18–1.1%从（P.c）均低于先前估算（1–8%）。结果表明培养液中的呼吸稀释效应很可能使这些值偏低。

由于需要对比整体和单细胞测量数据，对P*c.格选切样品进行单细胞碳同位素分析。所有检测实验样本中均发现高于天然丰度¹³C产富的细胞，但单细胞层面也显示出显著的细胞间异质性。群体中节存在低于天然丰度¹³C的细胞，可通过固定剂（PFA）稀释和样本制备过程中的未标记试剂引入来解释。此外，指数期的细胞平均¹³C富集率最高（高碳0.33%，低碳0.38%），与EA-IRMS结果一致；但是低碳条件稳定期样本的细胞异质性增加，这个在群落中可能反映了饥饿所诱导的生理异质性。

### 3.6 有机碳可利用性调控HICF

斯皮尔曼相关性分析显示，有机碳浓度是与δ¹³C值相关程度最强的变量，对*ip.car/*i}（rho=?0.77，P=0.003）和*ip. put/*（rho=?0.87，P=0.001）皆然。两菌株在低碳条件下均显示出更强的DIC同化，与“碳限制可以促进回补性DIC固定”的观点一致，亦与海洋及土壤环境研究的结果相互印证。这一模式也与氮限制条件下羧化酶基因表达增强的预测不完全一致——但在低碳条件下，物种更依赖回补固定维持TCA循环中间物。

### 3.7 温度对HICF的影响

温度与菌株δ¹³C值均呈中等程度的相关性（两菌均rho~+0.28），最适生长温度下的¹³C-DIC同化高于低温培养处理，这与最适温度下回补酶活性更高的预期一致，亦与浅地壳流体培养观察结果相符。

### 3.8 培养阶段对HICF的影响

指数期的细胞往往¹³C富集度高于静止期细胞，但标本培养基中呼吸产生的未标记CO₂会稀释DIC标记池，全部P. car*样品富集在实验室静止期上升的条件下观察到高DIC摄取，表明细胞在碳限制静止期激活回补途径，但此效应仅出现在碳限制（而非氮限制）条件下，并且似乎具有株特异性。

### 3.9 生化调控与酶学考量

<sub>P.* carrageenovora/i*培养基含TCA循环中间体（柠檬酸和琥珀酸），使得其直接补充循环底物降低了回补需求的贡献。相比之下，*iP. put*培养基含丰富氨基酸，后者可能有更强的代谢流向GNG/回补节点。基因组注释调查显示*ip.g. carrageenov*/i*拥有数量更多的羧化酶（如甲基巴豆酰辅酶A羧化酶）能够提供额外的DIC同化途径，而*ip. put.*/i*则缺乏，这些有助于解释两菌株在HICF量上的显著差异。

---

## 四、结论与生态意义

综上，碳限制、最优温度以及指数期被认为是*HICF*发生的主要正向驱动因素，而氮限制对固碳的促进作用反而有限。研究发现的*13C*-DIC标记下单细胞水平固定速率与地壳流体生物圈中数据吻合，证实了HICF对这些生态系统的潜在贡献。因此，在设计¹³C-DIC稳定同位素探测标记及研究碳循环时，必须考虑异养无机碳固定的动态可变性这一重要因素。</sub>