《Applied and Environmental Microbiology》：Prospective metagenomic sequencing of wastewater across the United States yields robust viral enrichment and concordance with digital PCR measurements
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摘要翻译：
宏基因组测序日益应用于污水，以表征人类和动物病毒的多样性、动态及相对丰度。在这些测序方法中，有的从污水基质中富集病毒核酸，旨在提高分析中病毒读段的比例。然而，将靶向病毒测序规模化推广至跨越大地理区域的不同污水流域的可行性目前尚属未知。在本研究中，研
摘要翻译：
宏基因组测序日益应用于污水，以表征人类和动物病毒的多样性、动态及相对丰度。在这些测序方法中，有的从污水基质中富集病毒核酸，旨在提高分析中病毒读段的比例。然而，将靶向病毒测序规模化推广至跨越大地理区域的不同污水流域的可行性目前尚属未知。在本研究中，研究人员对呼吸道病毒流行季节期间在美国采集的近450份每周污水样本应用杂交捕获宏基因组测序，并评估该测序性能以生成公共卫生相关数据。对来自15座污水处理厂的数据分析表明，该方法能够高效捕获目标病原体，病毒读段比例中位数超过19%。重要的是，常见病原体的相对丰度估计与使用逆转录微滴数字PCR对病毒靶标进行的直接定量结果相关。综上所述，研究结果表明，污水杂交捕获测序是监测地理多样化污水流域中常见和罕见病原体的可行工具。
重要性：
污水检测通常用于在社区尺度上识别和定量人类病原体。然而，最常用的方法依赖于针对单一病毒具有高度特异性的靶向PCR方法。宏基因组测序提供了从污水中检测和定量对人类健康重要的多种病毒相对丰度的机会，而杂交捕获方法首先富集样本中这些极其稀有的靶标以提高灵敏度。研究人员证明，杂交捕获宏基因组测序成功富集了来自美国不同地点的污水样本，且从序列中获得的数据与使用标准RT-ddPCR方法对11种关键病毒的检测结果相关联。这项工作表明，将针对污水中病毒的杂交捕获宏基因组学规模化，是为支持传染病疫情应对生成公共卫生关键数据的可行途径。
# 杂交捕获宏基因组测序在污水病毒监测中的规模化应用与验证：一项覆盖美国多流域的前瞻性研究解读
## 研究背景与科学问题
污水流行病学（Wastewater-Based Epidemiology, WBE）已成为监测社区尺度病毒性传染病的重要公共卫生工具，广泛应用于COVID-19、流感、猴痘和麻疹等疾病的早期暴发检测与应对指导。目前，全球大规模前瞻性污水监测项目主要依赖聚合酶链式反应（PCR）技术，如定量PCR（qPCR）或微滴数字PCR（digital droplet PCR, ddPCR），这些方法具有测量精确、周转快等优点。然而，PCR方法存在固有局限：可同时检测的靶标数量有限，且依赖高度特异和灵敏的寡核苷酸引物与探针。病毒基因组在短时间内快速演化，引物和探针序列需频繁调整以保持对流行变异株的敏感性和特异性；同时，引物和探针的设计前提是已知病毒基因组序列，这极大限制了PCR对新型病毒或高度变异株的检测能力。
基于测序的基因组监测为病毒WBE提供了PCR之外的替代方案。拼接扩增子测序已被广泛用于SARS-CoV-2变异株表征，但其主要缺陷是聚焦于单一病毒。近期，宏基因组方法被应用于病毒病原体WBE，但污水中病毒核酸仅占总核酸的极小部分，鸟枪法宏基因组测序常难以检测低丰度病毒，导致灵敏度估计高度可变。为克服此限制，探针杂交捕获技术能够在测序前富集病毒靶标，这种“半靶向”方法可将病毒测序读段富集数个数量级，并容忍与已知参考序列最高30%的序列偏差。此前仅在美国康涅狄格州纽黑文市单座污水处理厂（WWTP）的研究表明，杂交捕获测序获得的病毒读段计数与ddPCR对呼吸道和肠道病毒核酸的测量值呈正相关。然而，在不同采样条件下，杂交捕获方法相对于靶向分子方法的性能尚属未知。针对这一空白，本研究评估了杂交捕获宏基因组测序在美国15座WWTP每周采集的污水样本中检测病毒生物标志物的可行性，并系统比较其与逆转录ddPCR（RT-ddPCR）定量结果的一致性。
## 研究设计与技术方法概览
研究人员从美国12个州的15座WWTP（服务人口从31,000至350万不等，涵盖中西部、东北部、南部和西部），在2026年1月中旬至3月下旬的12周内每周采集约三次污水样本，共获得443份样本。样本类型包括初沉池污泥抓取样本或24小时复合初沉池进水样本。测序部分使用液体样本：污泥样本经离心取上清液，进水样本直接处理，经0.45 μm聚醚砜（PES）膜真空过滤去除细菌和真核核酸，采用Ceres Nanotrap Microbiome A颗粒浓缩病毒颗粒，MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit提取核酸，Zymo OneStep PCR Inhibitor Removal Kit去除抑制剂。cDNA合成使用ProtoScript II试剂盒，文库构建使用Twist Library Preparation Kit并连接Twist Unique Molecular Identifiers（UMI）接头系统。富集使用Twist Comprehensive Viral Research Panel（靶向超过3,000种病毒基因组，70°C杂交16小时），CRISPR-Cas9技术去除核糖体RNA（rRNA），在Illumina NovaSeq X Plus平台进行150 bp双端测序，每样本目标深度1亿读段。计算分析流程包括：HUMID基于UMI去重，Kraken2、bowtie2和HRRT迭代去除宿主读段，fastp修剪接头和UMI，EsViritu进行病毒分类和定量。RT-ddPCR定量在固体样本上进行，靶标包括SARS-CoV-2、流感A/B、呼吸道合胞病毒、人类偏肺病毒、肠道病毒D68、麻疹、诺如病毒GII、轮状病毒、甲型肝炎、细小病毒和西尼罗病毒。统计分析使用线性混合模型、Kendall's tau相关性、百分比一致性（PPA/PNA/OPA）等。
## 主要研究结果
### 杂交捕获宏基因组测序质量评估
在去除人类读段和去重后，443份样本共获得中位数4.9×10?个唯一读段对，中位重复率为0.97。经病毒分类后，中位病毒读段对数为8.4×10?，占比19.4%。五个站点（Jupiter、Lincoln、Traverse City、Las Vegas、Anchorage）的病毒读段百分比中位数超过25%。rRNA读段中位数占比7.7%。11个无模板对照（NTC）中病毒读段极少（每样本<300读段对），且仅来自4种病毒，推断广泛试剂污染可能性低。94.6%的样本达到高质量标准（重复率≤99%且唯一读段≥10?）。进水来源样本的病毒读段对数显著高于污泥来源样本，但两者重复率无差异。
### 杂交捕获宏基因组样本组成
从约7.6亿病毒读段对中鉴定出1,334种病毒和2,227种亚种，分属50个病毒科。最常见的病毒科为Sedoreoviridae（轮状病毒）和Astroviridae（星状病毒），合计占多数样本75%以上读段。Caliciviridae（诺如病毒）和Adenoviridae（腺病毒）次之。所有提供污泥样本的站点均显示较高的Adenoviridae相对丰度。Polyomaviridae、Coronaviridae、Papillomaviridae和Picobirnaviridae在>97%样本中检出；Paramyxoviridae和Orthomyxoviridae检出率分别为76%和83%。每样本中位检出230种病毒，人类腺病毒F、人类星状病毒和轮状病毒A在442/443份样本中检出。SARS-CoV-2、流感A、鼻病毒A/C和呼吸道合胞病毒在>71%样本中检出。人类偏肺病毒检出率为55%。麻疹和水痘检出率分别为6.3%和5.0%。α多样性（Shannon指数）中位数为1.79，除Jupiter、Portland和Rochester外，所有站点从1月到3月均呈显著下降趋势。Bray-Curtis相异性和NMDS排序显示，同一样本类型（进水vs污泥）和同一WWTP的样本组成更相似。
### 定量测序与ddPCR测量的关系
对于大多数靶标，RT-ddPCR的阳性检出率高于测序，麻疹除外。总体一致性百分比（OPA）在频繁检出（轮状病毒99.8%）或罕见检出（麻疹93.5%）的靶标中最高，在中等频率检出的呼吸道靶标中最低（如人类偏肺病毒48.8%）。阳性一致性百分比（PPA）在频繁检出的肠道病毒中高（腺病毒F和诺如病毒GII均为99.5%，轮状病毒99.8%），麻疹（9.4%）和甲型肝炎（28.1%）低。阴性一致性百分比（PNA）在西尼罗病毒中为100%。线性混合模型显示，RT-ddPCR浓度是测序RPKMF的显著正预测因子（斜率=0.52，95% CI 0.47–0.57），解释了12.4%的方差（边际R2），纳入城市、病毒和重复测量后解释83.5%总方差（条件R2），其中病毒靶标贡献71.8%的方差。按站点分析，Kendall's tau中位数为0.51，范围从San Jose的0.42到Lincoln的0.61；进水与污泥站点间tau值有小但显著的差异。按病毒靶标跨站点分析，相关性较弱，中位tau=0.07，RSV、麻疹、诺如病毒和甲型肝炎无显著关联。
### 麻疹敏感性与基因分型
研究期间RT-ddPCR共检出麻疹7次，其中3次与测序检出重合。测序在29份样本中检出麻疹，涉及7个站点。86%的测序检出读段主要映射至基因型D8；3份样本归因于疫苗株基因型A；另检出基因型D4（2个读段）和C1（4个读段，1.72%覆盖度）。一份来自Lincoln的样本获得1,070个D8读段，覆盖96.8%参考基因组，证明从污水宏基因组测序中获得近完整病原体基因组的潜力。杂交捕获测序对麻疹的灵敏度高于RT-ddPCR，并实现了基因型区分。
### 病原体关注读段的人工与半自动核查
对H5N1流感A、猴痘病毒、马尔堡病毒、脊髓灰质炎病毒、猪水疱病和禽副粘病毒1型等关注病原体的读段进行额外验证。脊髓灰质炎病毒读段经专门流程确认为非脊髓灰质炎肠道病毒C或肠道病毒C保守区；禽副粘病毒1型读段未覆盖融合蛋白裂解位点，无法确定致病毒力；H5N1和猴痘病毒读段均获确认；猪水疱病读段更匹配其他肠道病毒B种；马尔堡病毒读段仅与合成马尔堡病毒载体匹配，与参考和野生型基因组均不匹配，提示为合成序列污染。
## 讨论与结论总结
讨论部分指出，杂交捕获宏基因组测序有效富集了污水中的广谱病毒，病毒读段比例较此前鸟枪法宏基因组研究（0.1%–2.56%和0%–14.3%）提高数个数量级。三分之一的WWTP达到中位病毒读段比例超过25%，表明该方法在不同地理区域具有一致的富集效率。与RT-ddPCR的比较显示，尽管两种方法检测的样本基质不同（测序用液体，RT-ddPCR用固体），RT-ddPCR浓度仍是测序RPKMF的显著预测因子，且站点内关联性中等且一致。测序方法在低丰度靶标方面表现出优势，尤其麻疹检出率高于RT-ddPCR，这归因于杂交捕获探针对序列分歧的高容忍度以及测序只需检出基因组任意区域即可判定阳性。测序的独特优势在于可进行亚型/基因型鉴定，对流感、麻疹等易变异病原体具有内在稳健性，降低了持续维护PCR引物探针的操作负担。此外，测序为多种优先病原体提供了实质性的基因组覆盖度，支持下游亚型分型和系统发育分析。研究者也讨论了样本基质选择、深度测序预算、宿主/细菌核酸去除效率等因素对灵敏度的影响，并指出Birmingham站点持续低性能需要未来研究澄清。
研究结论可总结为：本研究证明杂交捕获测序可在美国各地具有不同特征和人口覆盖范围的WWTP中规模化应用，生成关于人类病毒存在和数量的信息，从而推断服务人群中的传染病流行情况。剩余挑战包括如何从大量信息中优先提取公共卫生可行动数据，以及如何超越对靶标随时间的存在和丰度追踪。本研究的目的是为该测序方法建立科学基础，以便未来转化工作探索如何利用这些数据保护公众健康。研究人员预期这些数据可用于识别新发病毒感染和暴发、态势感知以及各类应对活动，与目前基于PCR的数据应用方式类似。为使其成为有用的公共卫生工具，需优先实现湿实验和分析流程的快速周转，必要时确认分类，并对与重要健康结局相关的标志物结果进行标注。科学界应与公共卫生官员和临床医生紧密合作，理解如何优先处理和传达这些数据结果，并探索病毒基因组亚型分型和特征化如何最好地服务社区需求。
