《Emerging Contaminants》：J114 Prevents Short-chain Chlorinated Paraffin-Induced Damage to Female Germline Stem Cells by Inhibiting AIM2- and NLRP12-PANoptosome
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短链氯化石蜡（SCCPs）在人类母乳和血液中的浓度范围为1.4至1400 μg/L。在本研究中，研究人员分别以0、1.4、14、140和1400 μg/L浓度的SCCPs处理雌性生殖干细胞（FGSCs）24、48和72小时后发现，≥14 μg/L的SCCPs可
短链氯化石蜡（SCCPs）在人类母乳和血液中的浓度范围为1.4至1400 μg/L。在本研究中，研究人员分别以0、1.4、14、140和1400 μg/L浓度的SCCPs处理雌性生殖干细胞（FGSCs）24、48和72小时后发现，≥14 μg/L的SCCPs可抑制FGSCs的增殖并诱导FGSCs发生氧化应激。处理48小时后，浓度≥14 μg/L的SCCPs不仅降低了FGSCs的生物标志物水平，还增加了AIM2-和NLRP12-PANoptosome的成员水平。NLRP3和AIM2分别是AIM2-和NLRP12-PANoptosome中的关键蛋白，而J114（NLRP3/AIM2-IN-3）可有效抑制二者。研究人员随后分别使用0.025、0.1和0.4 μM的J114对1400 μg/L SCCPs诱导的FGSCs损伤进行24、48和72小时的干预。24小时后，≥0.1 μM的J114显著增强了FGSCs的增殖并抑制了其氧化应激。经0.1和0.4 μM的J114处理48小时后，FGSCs的生物标志物水平升高，AIM2-和NLRP12-PANoptosome被显著抑制。这表明低水平的SCCPs可抑制FGSCs增殖并诱导PANapoptosis，其机制在于SCCPs诱导了AIM2-和NLRP12-PANoptosome的形成。同时，≥0.1 μM的J114可通过抑制AIM2-和NLRP12-PANoptosome的产生来减轻/抑制SCCPs对FGSCs的毒性作用。
论文解读
一、研究背景与意义
短链氯化石蜡（SCCPs）是一类新兴持久性有机污染物（POPs），于2017年被斯德哥尔摩公约列为新兴POPs。SCCPs广泛存在于大气、水和土壤等环境介质中，也存在于包括婴儿食品在内的多种日常用品和食品中。人类和动物可通过呼吸、饮食和皮肤接触摄入SCCPs，可能引起肝脏、肾脏和免疫毒性效应，以及内分泌干扰、致癌和致畸作用。然而，关于SCCPs生殖毒性的研究十分有限，尤其是其对雌性生殖器官的损伤作用尚缺乏深入探讨。
雌性生殖干细胞（FGSCs）是近年来发现的存在于哺乳动物出生后卵巢中的生殖系干细胞，兼具干细胞的自我更新能力和生殖细胞的遗传信息传递特性。FGSCs不仅能在出生后产生新的卵母细胞，还能发育为卵巢类器官和成熟卵母细胞，在卵巢组织再生修复和卵巢功能重塑中发挥关键作用。环境污染物对FGSCs的损伤可能构成女性不孕的新机制。
PANoptosis是一种新发现的细胞死亡模式，以焦亡、凋亡和坏死性凋亡同时发生为特征，由PANoptosome蛋白复合物调控。已有研究表明，暴露于某些POPs可诱导PANoptosome形成并导致细胞损伤。SCCPs已被证明可通过诱导AIM2-和NLRP12-PANoptosome引起小鼠卵巢中FGSCs和其他细胞的PANoptosis，导致卵巢损伤。J114（NLRP3/AIM2-IN-3）是一种新型NLRP3依赖性焦亡小分子抑制剂，可干扰NLRP3或AIM2与衔接蛋白ASC的相互作用并抑制ASC寡聚化，从而有效抑制NLRP3和AIM2。
鉴于SCCPs在人类母乳和血液中的浓度范围为1.4至1400 μg/L，本研究旨在探究该环境相关浓度范围的SCCPs是否对体外培养的小鼠FGSCs造成损伤，并验证J114是否通过抑制AIM2-和NLRP12-PANoptosome的形成来保护FGSCs，从而阐明SCCPs诱导FGSCs损伤的机制并寻找可干预的药物。
二、主要技术方法
研究人员从6周龄小鼠卵巢中分离FGSCs，采用磁激活细胞分选（MACS）提取细胞并在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上培养。研究使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，采用ELISA试剂盒检测丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，使用DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）。通过透射电子显微镜（TEM）观察PANoptosome相关细胞形态变化，采用免疫荧光技术检测关键蛋白表达，利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测基因表达水平，并通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达量。统计分析采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett-t检验。
三、研究结果
3.1 SCCPs通过AIM2-和NLRP12-PANoptosome诱导FGSCs损伤
3.1.1 环境相关浓度SCCPs暴露诱导FGSCs损伤
与对照组相比，超低剂量组（1.4 μg/L）FGSCs数量在整个研究期间无显著差异，但低剂量（14 μg/L）、中剂量（140 μg/L）和高剂量（1400 μg/L）组在处理48和72小时后细胞数量显著降低。低、中、高剂量组的SOD活性显著低于对照组且随剂量增加逐渐降低，而MDA和ROS水平显著高于对照组且与SCCPs浓度呈正相关。处理48小时后，低、中、高剂量组FGSCs生物标志物（MVH、IFITM3和OCT4）的蛋白和基因水平均显著低于对照组，且随SCCPs剂量增加逐渐降低。这些结果表明，与人体血液/母乳中浓度相当的SCCPs可诱导体外培养的FGSCs损伤。
3.1.2 环境相关浓度SCCPs诱导FGSCs中AIM2-和NLRP12-PANoptosome的产生
处理48小时后，低、中、高剂量组的ZBP1蛋白和基因水平显著高于对照组。TEM观察显示，低、中、高剂量组FGSCs的染色质大多聚集在核膜周围，溶酶体肿胀，细胞膜破裂导致细胞内容物外溢。cleaved CASPASE-8、FADD和cleaved CASPASE-3的蛋白和基因水平在低、中、高剂量组中显著升高，表明SCCPs在14至1400 μg/L剂量范围内诱导FGSCs凋亡。双免疫荧光染色显示CASPASE-3和GSDMD荧光强度在低、中、高剂量组中高于对照组，TEM观察显示细胞膜逐渐向外膨胀并破裂，溶酶体肿胀，线粒体数量逐渐减少。焦亡相关蛋白AIM2、NLRP12、PYRIN、ASC、cleaved CASPASE-1、NLRP3、GSDMD和GSDME及其基因水平在低、中、高剂量组中均显著升高，表明SCCPs诱导FGSCs焦亡。AIM2和MLKL的荧光强度在低、中、高剂量组中高于对照组，RIPK1、RIPK3和MLKL的蛋白和基因水平也显著升高，表明SCCPs诱导FGSCs坏死性凋亡。由于凋亡、焦亡和坏死性凋亡同时发生即提示PANoptosome的存在，上述结果证实14至1400 μg/L的SCCPs暴露激活了PANoptosis相关通路，导致AIM2-和NLRP12-PANoptosome形成。
3.2 SCCPs损伤机制及J114在FGSCs中的保护作用
3.2.1 J114保护FGSCs免受SCCPs的有害影响并维持其干细胞特性
J114对照组与阴性对照组之间FGSCs数量无显著差异，表明J114本身对FGSCs无毒性作用。低剂量J114组与阳性对照组之间无显著差异，表明低剂量J114不能增强FGSCs的增殖能力。处理48小时后，中剂量和高剂量J114组的FGSCs数量较阳性对照组显著增加。处理72小时后，高剂量J114组与阴性对照组之间FGSCs数量无显著差异。中、高剂量J114组的SOD活性显著高于阳性对照组且随J114剂量增加逐渐升高，而MDA和ROS水平显著低于阳性对照组且随剂量增加逐渐降低。处理48小时后，中、高剂量J114组FGSCs生物标志物（MVH、IFITM3和OCT4）的蛋白和基因水平显著高于阳性对照组。这些结果表明，J114不仅保护FGSCs的增殖能力，还以剂量依赖方式抑制SCCPs诱导的氧化应激，0.1至0.4 μM的J114可保护FGSCs的干细胞特性免受SCCPs损伤，其中0.4 μM效果最佳。
3.2.2 J114抑制FGSCs中AIM2-和NLRP12-PANoptosome的产生
处理48小时后，中、高剂量J114组的ZBP1水平显著低于阳性对照组。TEM观察显示，中、高剂量J114组FGSCs的凋亡较阳性对照组明显减少，与阴性对照组和J114对照组基本无差异。cleaved CASPASE-8、FADD和cleaved CASPASE-3的蛋白和基因水平在中、高剂量J114组中显著低于阳性对照组。双免疫荧光染色显示，低、中、高剂量J114组的CASPASE-3和GSDMD荧光强度均低于阳性对照组。TEM观察显示，中、高剂量J114组的焦亡程度较阳性对照组轻。AIM2-PANoptosome蛋白（AIM2、PYRIN、ASC、cleaved CASPASE-1）及其基因、NLRP12-PANoptosome蛋白（NLRP12、ASC、cleaved CASPASE-1、NLRP3）及其基因，以及焦亡蛋白（GSDMD和GSDME）及其基因在中、高剂量J114组中均显著低于阳性对照组。双免疫荧光染色显示，中、高剂量J114组的AIM2和MLKL荧光强度低于阳性对照组，TEM观察显示坏死性凋亡明显减轻。RIPK1、RIPK3和MLKL的蛋白和基因水平在中、高剂量J114组中显著低于阳性对照组。以上结果表明，中、高剂量J114不仅同时抑制了SCCPs诱导的FGSCs凋亡、焦亡和坏死性凋亡，还降低了AIM2-PANoptosome和NLRP12-PANoptosome的蛋白和基因水平，0.1至0.4 μM的J114可显著抑制SCCPs诱导的FGSCs PANoptosis。
四、讨论与结论
讨论部分总结： 研究人员前期研究发现环境水平的SCCPs可通过NLRP12-和AIM2-PANoptosome诱导小鼠卵巢损伤。本研究证实，14至1400 μg/L的SCCPs处理FGSCs可显著抑制细胞增殖并增加氧化应激，这可能是因为氧化应激是触发PANoptosome产生的刺激因素之一。ZBP1是触发PANoptosome起始的最关键模式识别受体，对调控RIPK1/RIPK3-FADD-CASP8细胞死亡复合物和PANoptosome的组装至关重要。SCCPs作为POPs可升高FGSCs中的氧化应激水平，进而诱导ZBP1及AIM2-和NLRP12-PANoptosome形成相关主要基因和蛋白的上调，最终导致FGSCs发生PANoptosis。SCCPs影响FGSCs干细胞特性可能有两方面原因：一是POPs可通过细胞凋亡破坏干细胞特性；二是PANoptosome的存在导致FGSCs损伤，使其干细胞特性降低或完全丧失。J114不仅通过阻断NLRP3-ASC相互作用抑制caspases-4/5/11的激活和异常NLRP3炎症小体，还破坏AIM2与ASC的相互作用并抑制ASC寡聚化。由于AIM2、NLRP12和NLRP3是NLRP12-PANoptosome的核心组分，J114可同时干扰AIM2-和NLRP12-PANoptosome。0.1和0.4 μM的J114抑制了SCCPs诱导的FGSCs氧化应激并减轻或逆转了SCCPs的损伤效应，这可能是因为氧化应激激活NLRP3和AIM2，而当氧化应激被抑制时这两种蛋白被下调。J114通过干扰NLRP3或AIM2与衔接蛋白ASC的相互作用并抑制ASC寡聚化，有效抑制NLRP3和AIM2，进而下调ZBP1并抑制SCCPs诱导的FGSCs中AIM2-和NLRP12-PANoptosome的激活。
结论部分翻译： 总之，人群血液水平的SCCPs抑制了体外培养的FGSCs的细胞增殖并导致细胞内PANoptosis，这归因于SCCPs激活了PANoptosis相关通路，提示AIM2-和NLRP12-PANoptosome的形成。0.1 μM及以上浓度的J114通过抑制PANoptosis相关通路减轻/抑制了SCCPs诱导的FGSCs PANoptosis。遗憾的是，研究人员尚未考察J114对SCCPs诱导的卵巢损伤的体内干预效果，以及J114如何下调ZBP1的机制，这些方面将在未来研究中深入探讨。
