斑马鱼胚胎毒理基因组学特征为基于作用模式（MoA）的生态毒理危害筛查提供资源

《Environment International》：Toxicogenomic signatures in zebrafish embryos provide a resource for mode-of-action-informed ecotoxic hazard screening

　　

根据其应用，化学品可能进入环境并对生物体产生有害影响，因此环境危害评估（environmental hazard assessment, EHA）作为大多数审批流程的一部分是必要的。然而，化学品数量的不断增加以及EHA所需的大量资源——在时间、成本和动物使用方面——对遗留和未来化学品管理构成重大挑战。在此，研究人员在符合3R原则（replacement, reduction and refinement）的斑马鱼胚胎模型中采用毒理基因组学分析，以探索可能支持作用模式（mode of action, MoA）指导的危害筛查的候选分子特征。利用已发表研究的数据和本研究新收集的数据，通过差异基因表达分析（differential gene expression analysis, DGEA）对总共32种代表19种不同MoA的物质进行分析，随后进行基于随机森林（random forest, RF）的候选MoA相关基因表达特征鉴定、基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）后的生物过程（biological process, BP）以及连接图谱（Connectivity Mapping, CMap）。所得公开可用的数据集为预监管危害筛查和物质优先排序提供了基础，有助于开发资源高效且减少动物使用的EHA方法。

化学品已成为现代生活的重要组成部分，但化学品污染可对环境生物产生不利影响，因此环境危害评估（EHA）是当代化学品审批与管理的关键环节。当前监管框架仍严重依赖动物测试，这与3R原则相冲突，并存在资源、时间和伦理方面的挑战；同时，传统测试多聚焦有限顶端终点，机制洞察不足。新方法方法学（new approach methodologies, NAMs）逐渐兴起，其中OMICs技术成为生态毒理学重要NAM。尽管如此，化学诱导的转录组反应能否区分特定MoA与更广泛毒理效应和一般应激反应，尤其在跨实验、跨化学品和跨暴露条件整合数据时，仍不明确。因此，研究人员开展本研究，旨在建立探索性、预监管、符合3R原则的框架，在斑马鱼胚胎中识别MoA相关转录组和功能反应模式；经独立验证后，该方法可支持动物测试细化、物质优先排序，并早期标记监管关注MoA，如内分泌干扰（endocrine-disrupting, ED）MoA。该论文发表在《Environment International》，作者包括Fatma Marghany等。

关键技术方法不超过250字：研究整合已发表数据和本研究新生成毒理基因组学数据，样本来源为德国Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology（IME）的野生型AB株斑马鱼胚胎，暴露参照OECD急性毒性试验指南No. 236并修改，收集96 hpf胚胎RNA。共分析32种物质、19种MoA。主要方法包括RNA-seq与统一DGEA工作流（DESeq2）、跨数据集主成分分析（PCA）、两种CMap模式匹配评分及准确性、敏感性、特异性评估、基于RF从DGEA筛选候选MoA分子特征、GSEA分析GO-BP并用RF筛选BP特征；数据公开于ArrayExpress和Zenodo，脚本公开于GitHub。

研究结果如下。3.1 测试物质与MoA的DGEA：研究人员分析32种化学物质，包括杀虫剂、杀菌剂、药物和激素，属于19个MoA；物质选择基于明确MoA信息，部分为特定MoA标准参考物，如ED天然激素。预实验确定低暴露（LE）和高暴露（HE）亚致死浓度；大多数物质呈浓度依赖性转录组反应。跨数据集PCA显示按化合物实验聚类，对照中也存在，提示基线转录组变异；溶剂使用也有影响，单端和双端测序配置在主要主成分无明显分离。后续分析基于实验内暴露与匹配对照的log₂-fold change，以减少基线变异，但残留实验异质性仍需考虑。3.2 DGEA数据的CMap聚类：研究人员评估不同输入基因集大小和排序标准，比较向量和聚合CMap评分，在LE、HE及交集条件构建60个模型，并以准确性、敏感性、特异性评估。Pearson相关总体优于GSEA；HE准确性较低，可能与系统毒性应激或同MoA物质方向不一致有关。log₂-fold change排序优于padj和stat，top 20优于top 50和top 100。最高准确性0.77由top 20 log₂-fold change、LE或交集、Pearson获得；最佳模型为top 20 log₂-fold change交集，敏感性0.44、特异性0.79。由于模型选择和评估在同一参考集，结果可能偏乐观，CMap被作为探索性全局相似性工具。应用最佳模型后，同特定MoA物质可高连接，如乙酰胆碱受体激动剂imidacloprid和nicotine、甲状腺过氧化物酶（thyroperoxidase, TPO）抑制剂methimazole和6-PTU；许多物质按更广泛MoA类别聚类，如fipronil和chlorpyrifos；ED化学品正连接，tamoxifen与ethinylestradiol呈正连接分数；T₃、metalaxyl、abamectin和boscalid聚类，原文提示生态毒理MoA可能是其交汇点；estradiol和methyltestosterone紧密聚类，可能与甲基睾酮芳构化为雌激素有关。但部分同主要MoA物质未邻近聚类，是该方法的限制。3.3 基于RF从DGEA数据识别MoA特征：RF识别top 100 MoA区分DEGs，其log₂-fold change约在?2到+2，并非变化最大基因，可能MoA特异反应被一般应激掩盖。17个MoA、26种物质检测到明显基因表达簇；cartap hydrochloride、spirotetramat、androstenedione、fulvestrant、bisphenol A和prochloraz未检测到，因HE DEGs未进入top 100。举例而言，hsp90b1、gch2和chia,1在TPO与脱碘酶（deiodinases, DIO）甲状腺干扰MoA中呈相反方向；si:dkey-23n7,10、arap1a、urgcp、socs3区分雄激素受体（androgen receptor, AR）激动剂和拮抗剂；socs3、epd、ifrd1、mid1ip1a、prelid3b、si:ch73-141c7,1、tmem176l,2在雌激素受体（estrogen receptor, ER）激动剂和调节剂中呈相反方向；cyp19a1b在雌激素和雄激素MoA中上调。先前研究提出的甾醇生物合成抑制剂、甲状腺干扰和性内分泌干扰候选标志物部分被恢复。RF流程为监督性、MoA引导的特征发现方法，不是无偏高维分类器训练，所得基因应视为候选MoA相关签名，需独立验证。3.4 基于RF从GSEA数据选择BP特征：GSEA使用相同基因集，在24种化学品、17个MoA中识别候选功能模式。以带符号归一化富集分数（normalized enrichment score, NES）为预测值，严格候选MoA相关签名要求在所有同MoA化合物中出现且非零NES方向一致。多数检测BP较通用。甲状腺干扰物质富集有机酸和羧酸代谢及转运；TPO抑制有硫酸化、核苷代谢、芳香化合物分解和儿茶酚化合物代谢等特征；6-PTU表现为混合甲状腺干扰签名。雌激素/雄激素相关中，有机酸分解、羧酸分解、α-氨基酸代谢和小分子生物合成常见改变；但methyltestosterone和trenbolone共享GO方向相反，未保留为AR激动剂共同签名；ER激动剂和调节剂及methyltestosterone抑制这些过程，trenbolone激活；flutamide、estradiol和ethinylestradiol影响细胞对激素刺激反应。difenoconazole和epoxiconazole富集氧化应激、脂质修饰、免疫激活和细胞粘附，神经系统过程受抑制，提示潜在神经毒性；脂质修饰与甾醇生物合成抑制MoA相关。神经毒性MoA五个亚组中，乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）抑制剂和乙酰胆碱受体激动剂共同富集小分子分解和单羧酸代谢；AChE抑制剂一致签名包括感觉知觉、神经系统功能、自噬和异生物反应，carbaryl和chlorpyrifos细胞周期相关方向相反。结论是，方向一致的分子和功能模式支持候选MoA相关签名识别，带符号NES和方向一致要求可区分常见功能反应与反相关通路调控。

讨论部分表明，跨数据集PCA显示实验和化合物相关聚类，对照中也有，确认基线转录组变异；溶剂使用有贡献，测序配置无清晰分离。比较分析基于实验内暴露与匹配对照的log₂-fold change，减少但不能消除残留异质性。未来应统一协议、一致控制、随机化、共享参考物质和完整元数据。三种转录组方法互补：CMap评估全局相似性，适合探索性分组、与参考物质比较和未知MoA假设生成，但连接分数可能反映更广泛毒理类别或次级反应；RF分子签名选择为监督方法，识别区分预定义MoA的基因，支持候选生物标志物优先排序，但性能依赖参考物数量多样性、MoA注释准确性和暴露相关变异。当前每个MoA参考物数量不均且部分有限，单一或两个化学品的MoA信息有限，特征可能为化合物特异；RF模型应视为监督特征发现工具而非验证预测分类器，因特征选择和解释使用同一数据集MoA注释且无独立测试集。GSEA/RF提供功能解释，但可能掩盖基因特异效应，受基因集注释、富集阈值和MoA内异质性影响；组合方法有优势。GO-BP特征广泛，不能作为单一MoA特异生物标志物，而是组合富集模式。暴露浓度未完全统一，浓度依赖可能影响模式；未来应采用匹配顶端效应水平、基准浓度、转录组点或浓度-反应设计。当前数据集为候选MoA相关分子和功能签名基础，未来需在独立、统一、扩展数据集中外部验证，评估可重复性和可转移性，并发展预监管危害筛查的预测MoA分类模型。

研究结论翻译：本研究提示，斑马鱼胚胎中的毒理基因组学分析可能支持利用符合3R原则的NAM开发基于MoA的环境危害筛查方法。通过整合32种化学品、19个不同MoA的转录组数据集，研究人员识别出与神经毒性、内分泌干扰和代谢抑制化学品相关的候选分子和功能反应模式。连接图谱、RF特征选择和GSEA的组合能够检测化合物特异和更广泛MoA相关反应模式。连接图谱表明，转录组相似性常反映化学品之间共享的生物效应和机制关系，尽管聚类在更广泛毒理类别层面常强于狭义主要MoA层面。同时，RF分析在当前参考数据集中识别出候选MoA相关基因和BP特征。重要的是，若干先前提出的生物标志物候选被本工作流恢复，支持其进一步研究优先性。研究人员对MoA特异性签名和标志物的研究部分基于代表其MoA的单一物质；尽管基于MoA数据仔细选择，不能排除这些标志物对该物质特异而不一定对MoA特异。该限制可通过未来研究使用当前数据集识别和验证稳健MoA相关标志物加以解决。总体而言，生成的毒理基因组学资源为探索性比较生态毒理基因组分析提供了公开可用基础，并可能支持机制知情、减少动物的危害评估策略。在扩展、统一的参考数据集独立验证之前，这些候选签名尚不能发展为预测性MoA分类模型。