mRNA工程化干细胞产生神经营养因子并在受体细胞中诱导神经突起生长

《Experimental Cell Research》：mRNA-Engineered Stem Cells Produce Nerve Growth Factor and Induce Neurite Outgrowth in Recipient Cells

　　

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  体外转录mRNA在递送效果上优于重组神经生长因子蛋白
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  神经生长因子mRNA能强有力地诱导神经发生分化
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  蛋白质组学揭示了神经生长因子mRNA激活的神经发生通路
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  mRNA转染细胞分泌的神经生长因子可诱导神经发生分化

引言

骨组织由称为骨单位的结构单元组成，骨单位包含一个中央管，其中含有神经和血管。这表明骨是一种高度神经支配和血管化的组织。[1] 尽管骨组织血管化的功能已被充分证实，但骨组织工程师们往往忽略了神经支配在骨中的作用。[2], [3] 从生理学角度来看，感觉神经纤维对骨骼的神经支配对于感知疼痛和其他感觉刺激至关重要。关于骨中神经支配的不同功能，目前所知甚少。近期的研究努力揭示了神经支配会影响成骨细胞和破骨细胞的活性。[4], [5] 例如，在骨创伤发生时，感觉神经中的神经递质或肽类上调已被证明能正向调控组织修复过程中的成骨和破骨过程。[4], [5] 此类神经支配事件对于骨稳态至关重要，能刺激骨形成并抑制骨吸收。[5] 此外，由于其解剖学上的邻近关系，骨骼神经与血管之间相互影响，这一点也从通路交叉和对刺激的联合反应中得到了证实。[6]

已知神经支配在骨发育早期就会发生。Zhu Li等人优雅地表明，骨折骨痂的再神经支配发生在血管化、骨化和矿化之前的时间点。[7] 再神经支配过程被证明是由神经生长因子上调触发的，这一上调在应力性骨折后立即发生。[7] 这些发现强调了将神经支配线索整合到新型骨愈合疗法中的重要性。这些发现支持对神经支配作为骨再生策略的额外生物学组成部分进行研究，与基质沉积和血管化相辅相成。[8], [9] 遗憾的是，该领域的研究仍然有限。

神经生长因子被广泛认为是外周神经再生和组织神经支配的关键因素。[10] 它能促进外周神经的生长、维护和存活，并诱导神经前体细胞（如神经诱导多能干细胞、背根神经节细胞或PC12细胞系）分化为具有特定特征（如体外神经突起）的成熟神经细胞。[11], [12], [13], [14] 神经生长因子已被报道与体外成骨[15], [16]和体内骨愈合模型[17], [18]相关。然而，相关证据仍然不足，其作用机制尚未完全阐明。作为重组人蛋白用于骨折愈合可能可行，但蛋白质疗法存在诸多挑战。神经生长因子的药代动力学较差，大鼠皮下注射后分布半衰期约为5.4分钟，消除半衰期为4.5小时。[19] 类似地，重组神经生长因子人体肌内注射后的消除半衰期也被报道为6小时。[20] 持续皮下输注神经生长因子已被证明有效，但在移除输注装置后神经生长因子水平迅速下降。[19] 这表明，在骨愈合过程中可能需要超生理浓度才能确保稳定且功能性的神经支配，这可能导致通路过度刺激、再生组织质量差以及免疫反应，正如在大剂量给予人体骨形态发生蛋白-2和-7时观察到的情况。其他局限性还包括由于所需的翻译后修饰、真核生物特异性过程以及批次间变异而导致的重组蛋白生产困难。[21], [22], [23]

我们及其他研究者已展示了在组织修复尝试中使用信使RNA替代重组蛋白的效用。[21], [22], [24], [25], [26] 此外，化学修饰的mRNA解决了mRNA药物通常伴随的稳定性、毒性和免疫原性问题，使其能够安全地应用于治疗。[27], [28], [29], [30] 我们之前的研究证明，低剂量的骨形态发生蛋白-2 cmRNA足以在体内强有力地刺激骨愈合，效果优于重组骨形态发生蛋白-2，再植标本表现出更优的改建和生物力学性能。[22], [26] 有利的是，给予的cmRNA保持在局部，未分布到循环系统或器官中。[22] 这些证据支持了这样的信念：少量的cmRNA就足以保证治疗效果，同时确保经济性并减少副作用。

在本研究中，我们开发了一种能够诱导神经生长的cmRNA构建体。因此，我们通过体外转录合成了神经生长因子cmRNA，包括我们先前工作中发现的相关结构修饰。评估了神经生长因子cmRNA的生物相容性和转染效率。对不同脂质载体进行了评估，以寻找将该分子递送至培养细胞的最佳载体。为测试所开发的神经生长因子cmRNA的功能性，采用了神经生长因子cmRNA转染的骨髓来源干细胞与神经细胞共培养系统。仔细研究了神经生长因子的表达及由此产生的神经突起生长情况。为了解神经生长因子cmRNA转染所刺激和/或抑制的细胞过程，对转染后的干细胞以及接受者神经细胞的分泌物和蛋白质组进行了分析。我们假设，转染后的干细胞将产生功能性神经生长因子，进而使接受者神经细胞发生分化。

章节摘要

细胞系

A549细胞购自ATCC（#CCL-185）。这是一种快速分裂的、类似上皮的人类细胞，来源于一名58岁白人肺癌患者的肺组织。正如我们小组此前所使用的，A549细胞为cmRNA构建体和递送条件的初步筛选提供了可靠且可重复的平台。[27] 在本研究中，它们被用于根据蛋白表达量对大量cmRNA浓度、脂质载体和cmRNA与脂质比率的矩阵进行筛选。

脂质与cmRNA成功组装成具有核-壳结构的脂质体复合物

cmRNA与所研究的各种脂质载体成功形成复合物。平均水合直径、多分散性指数和Zeta电位值汇总于表S1。由RmesFect??、NL37、3D-FectIN??和3D-Fect??形成的脂质体复合物具有较大的复合体特征，平均水合直径在700–1100纳米范围内，而NL51和Lipofectamine?? MessengerMax??则形成显著较小的约200纳米复合体（p < 0.05，图1A）。当比较大小时

讨论

近年来，神经支配对组织修复和再生至关重要这一点已日益明显，正如在器官发生过程中一样。[8], [35] 因此，神经支配对组织工程的重要性远远超出了神经系统的疾病治疗范畴。一些高度神经支配组织的例子包括皮肤、肠道和骨骼。[36], [37], [38] 在愈合过程中辅助骨组织神经支配的策略尚未得到广泛研究。然而，令人欣慰的是

CRediT作者贡献声明

Florent Poulhes：写作 – 审阅与编辑，资源，形式分析。Elise Bonvin：写作 – 审阅与编辑，资源，资金获取，形式分析。Berta Cillero-Pastor：写作 – 审阅与编辑，方法学，形式分析。Christian Plank：写作 – 审阅与编辑，资源，资金获取，形式分析。Elizabeth R Balmayor：写作 – 原创草稿，可视化，监督，资源，资金获取，概念构思。Claire Polain：写作 – 原创

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已获所有参与者或其法定代表签署知情同意书，同意参与本研究并发表本文。参与者的隐私权得到了尊重。

本研究包括器官或组织捐献者。本研究包含人类生物材料，已获捐献者、其近亲或法定代表同意用于本研究及本文发表。本研究中使用的样本并非来源于

伦理声明

骨髓样本在获得当地MUMC+伦理委员会（批准编号MUTC 15-4-274）伦理批准后，经书面知情捐献者同意采集。所有程序均按照《赫尔辛基宣言》最新修正案进行。

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C.P.是Ethris GmbH的创始人、雇员和股东。E.B.和F.P.是OZ Biosciences SAS的雇员。OZ Biosciences SAS拥有专利#US9107931B2并已授权。

数据可用性声明

数据集已存入Dataverse，自发表之日起公开发布，访问链接为：https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=91ba9b49-907c-4ee3-8d95-b99d2c903de4。DOI：10.34894/AX95AR。

基金

本研究由欧盟地平线2020研究与创新计划资助，作为cmRNAbone项目的一部分，资助协议编号为874790。

利益冲突声明

? 作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在利益冲突：EB、FP、CP、MvG和ERB报告获得了欧盟研究与创新框架计划未来和新兴技术项目的资金支持。EB和FP报告与OZ Biosciences SAS存在包括雇佣关系在内的关系。CP报告与Ethris GmbH存在包括雇佣关系在内的关系。OZ Biosciences SAS拥有专利#US9107931B2并已授权

致谢：

C.J.P.S.和M.v.G.感谢林堡省"林堡投资其知识经济"项目提供的支持。

Claire Polain|Claudia Del Toro Runzer|Freek G. Bouwman|Timo Rademakers|Mirella Haartmans|Carlos Julio Peniche Silva|Elise Bonvin|Florent Poulhes|Christian Plank|Berta Cillero-Pastor|Martijn van Griensven|Elizabeth R. Balmayor