甘草酸诱导α-乳白蛋白形成的非单调浓度依赖性水凝胶：基于多光谱学和分子动力学方法的机理洞察

《Food Chemistry》：Non-monotonic concentration-dependent hydrogel formation of α-Lactalbumin induced by glycyrrhizin: Mechanistic insights from multi-spectroscopic and molecular dynamics approaches

　　

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  首次绘制α-乳白蛋白/甘草酸水凝胶相图，明确了浓度依赖的凝胶化窗口。
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  甘草酸诱导可控的疏水性暴露，并降低了反平行β-折叠的含量。
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  疏水相互作用主导网络组装，氢键和静电力作为协同贡献者发挥作用。
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  可凝胶体系表现出剪切变稀流变行为、关键粘度阈值以及增强的结合水含量。
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  分子动力学模拟揭示甘草酸增加了α-乳白蛋白与甘草酸之间的氢键数量，同时降低了蛋白质和水的扩散系数。

引言

水凝胶是三维亲水性网络结构，广泛用于食品、生物医学和制药领域的封装和控释应用（Briones等，2025年）。蛋白质基水凝胶因其生物相容性、可消化性（Lu等，2023年）以及模拟细胞外基质的能力（Scopelliti等，2026年）而格外具有吸引力。然而，许多蛋白质在温和条件下表现出有限的内在凝胶化能力，通常需要极端pH值（Khalesi等，2024年）、高温（Kumar和Aswal，2024年）、化学交联剂（Alavarse等，2022年）或酶处理（Gaspar和de Góes-Favoni，2015年）才能形成稳定的网络结构。这些方法可能会损害负载营养素的生物活性，或限制其在精细食品基质中的应用。α-乳白蛋白（α-La）是一种分子量为14.2 kDa的Ca²⁺结合蛋白，占牛乳清蛋白的20–25%，具有紧凑的、由二硫键稳定的结构（Permyakov和Berliner，2000年）。在天然状态下，即使α-La浓度高达20%（w/v），也不会形成热诱导凝胶（Paulsson和Castberg，1986年）。在酸性条件下，加热仅导致无定形聚集，只有在特定碱性条件下才能观察到凝胶化（Boye等，1997年）。因此，迫切需要温和且完全天然的凝胶化策略来构建α-La基水凝胶网络。

甘草酸（Gy）是从甘草根中提取的主要生物活性皂苷。在化学结构上，甘草酸是一种三萜皂苷，由一个疏水性苷元连接两个葡萄糖醛酸残基组成，使其成为兼具疏水性和亲水性的两亲分子（Pastorino等，2018年）。甘草酸被广泛用作天然甜味剂，其甜度约为蔗糖的30–50倍，并被公认具有多种药理学活性，包括抗炎、抗病毒、保肝和抗氧化特性（Semwal等，2025年）。重要的是，甘草酸可通过氢键、疏水相互作用和金属离子配位自组装形成超分子水凝胶（Xiao等，2026年），充当天然的低分子量凝胶剂。近年来，甘草酸也被研究作为蛋白质基体系的交联或共组装伙伴。例如，甘草酸通过疏水相互作用和氢键与大豆分离蛋白形成非共价复合物，作为槲皮素等疏水性多酚的肠道靶向递送载体（Cui等，2024年）。当甘草酸与各种植物来源的蛋白质结合时，研究表明它可以改变蛋白质构象、增强结构柔韧性并提高包埋效率（Cui等，2023年；Wang等，2025年）。关于α-乳白蛋白，我们之前的研究证明甘草酸主要通过氢键和范德华力与α-La相互作用，从而增强α-La的起泡能力以及α-La稳定油/水乳液的物理稳定性（Shi等，2022年；Shi, Gao等，2024年；Shi等，2026年）。然而，α-La/Gy复合水凝胶的形成，特别是调控凝胶化的浓度依赖相互作用，尚未被系统地阐明。

本研究旨在系统阐明α-La/Gy复合水凝胶的非单调浓度依赖形成机制。尽管α-La与甘草酸之间的相互作用已知，但驱动凝胶化的关键浓度阈值、非共价力的层级作用以及分子构象变化仍知之甚少。为弥补这些空白，我们综合运用了多种光谱技术（ANS结合、固有荧光、紫外二阶导数吸收、傅里叶变换红外光谱）、流变学测量、低场核磁共振、扫描电子显微镜和分子动力学模拟。本研究不仅全面揭示了甘草酸如何以浓度依赖的方式诱导α-La凝胶化，还为设计具有可调特性的温和蛋白质基水凝胶提供了合理的理论基础，使其可应用于功能性食品、营养递送系统和蛋白质基生物材料领域。

章节摘要

材料

α-La和8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。甘草酸购自上海源叶生化科技有限公司（上海，中国）。氯化钠和尿素购自阿拉丁工业股份有限公司（上海，中国）。其他所有化学试剂均为分析纯级别。全程使用蒸馏水配制溶液和水凝胶。

水凝胶的制备及相图的构建

α-La溶液（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和8.0% w/v）

相图分析

系统研究了α-La（0.1–4.0% w/v）在甘草酸（0–25.0 mM）存在下的凝胶形成能力。在所得相图中（图S1），深紫色表示自支撑水凝胶的形成，而浅紫色表示未发生凝胶化。结果表明，凝胶区域并未覆盖所有浓度组合，而是呈现出清晰的相边界。在任何α-La浓度下，若无甘草酸均不发生凝胶化（所有样品归类为溶液）。凝胶化仅在……时观察到

结论

本研究系统阐明了甘草酸诱导α-La水凝胶的形成机制，关键发现为非单调的浓度依赖性。凝胶化仅在α-La浓度为0.1–1.0%且甘草酸阈值范围为3.0–15.0 mM时发生。值得注意的是，纯甘草酸（3.0–25.0 mM）可自行形成水凝胶，而当α-La浓度≥ 2.0%时，在任何甘草酸浓度下均未观察到凝胶化。主要发现包括表面疏水性的适度增加，

CRediT作者贡献声明

施瑞杰： 撰写——初稿、软件、方法论、调查、资金获取、正式分析。詹美江： 撰写——审阅与编辑、监督。袁丽霞： 验证、概念化。王清鹏： 调查、资金获取。高增利： 可视化、资源。沐智深： 监督、项目管理。

伦理声明

作者声明本研究不涉及人类或动物实验对象。

未引用参考文献

Al-Hanish等，2016

Balderas-Leon、Cardador-Martinez、Baigts-Allende、Velazquez-Carriles和Silva-Jara，2024

Jiang等，2025

Li等，2023

Xu等，2022

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本论文所述工作的已知经济利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到山东省自然科学基金（ZR2025QC257）、中国国家博士后科学基金（2023 M741834）、山东省高校青年科技创新项目（2021KJ099）以及聊城大学博士研究基金（318052261）的资助。

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