基于源内碎片离子辅助注释的非挥发性代谢组学方法实现西湖龙井明前茶地理来源与品质等级鉴别

《Food Chemistry: X》：Non-volatile metabolomic differentiation of geographical origin and quality grade in pre-Qingming Xihu Longjing green tea using in-source fragment ion-assisted annotation

　　

专业术语翻译（摘要部分） 西湖龙井绿茶（Xihu Longjing green tea，XHLJT）是一种地理标志（geographical indication，GI）产品，因其独特的感官品质和生物活性植物化学成分（包括儿茶素、黄酮类、生物碱和有机酸）而备受珍视。在GI体系内，生产集中于西湖产区，其中狮峰（SF）、龙井（LJ）、云栖（YQ）、虎跑（HP）和梅家坞（MJW）等核心产区在历史上得到公认。与此同时，商品化XHLJT依据综合品质属性（T/XHLJ 001–2021）被常规划分为特级（SG）、一级（1G）和二级（2G）等层级。鉴于XHLJT相较于普通绿茶具有显著的价格溢价，可靠的地理来源与等级鉴别对于消费者保护和市场监管至关重要。然而，错误标签和掺假问题仍然频发，导致标注品质与实际品质之间存在偏差，并使供应链监管复杂化。 绿茶的感官品质特征在很大程度上取决于氨基酸、儿茶素、黄酮类和生物碱之间的平衡，这些成分共同决定鲜味、苦味和涩味。重要的是，这些代谢物的积累对环境因素（如土壤组成、气候条件和栽培措施）以及支撑商业分级体系的叶片成熟度和采摘标准高度敏感。因此，地理来源和等级的差异往往反映在绿茶代谢物组成的系统性差异上，提示代谢组学图谱可为来源和品质鉴别提供客观的化学特征。 然而，目前XHLJT等级划分仍主要依赖专家对干茶外形、香气、汤色、滋味和叶底特征的感官审评。尽管感官评估对品质控制不可或缺，但其结果可能受主观性和评审组间差异影响，且对感知品质的分子基础提供的化学可解释性有限。这些局限推动了客观的、基于化学的方法的发展，以将组成特征与来源和等级联系起来。在此背景下，基于超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC–HRMS）的非靶向代谢组学已成为茶叶表征的重要策略，能够实现非挥发性代谢物的全面分析并生成判别性分子指纹。 UHPLC–HRMS茶叶代谢组学的主要瓶颈在于代谢物鉴定的可靠性。茶叶含有大量结构相关的多酚及其通过羟基化、甲基化、糖基化和聚合形成的衍生物。由于这些化合物常产生相似的MS/MS谱图，基于数据库的注释容易产生歧义。此外，茶叶特异性参考标准品的有限可获得性进一步制约了可靠鉴定。因此，代谢物注释的可靠性不仅取决于谱图匹配，还取决于质谱特征的有效预处理。 电喷雾电离过程中的源内碎裂会在靶向MS/MS采集之前产生源内碎片离子（in-source fragment ions，ISFIs）。若ISFIs未被系统识别并关联至相应前体离子，则可能被误判为独立代谢物，导致特征表膨胀，并损害下游谱库匹配和化学计量学分析。已有多种计算策略应对此问题，例如Scaffold Elements算法对共洗脱的MS1特征进行分组并利用源内碎片信息支持代谢物注释；RAMClust和CAMERA亦基于色谱行为和信号相关性促进相关离子特征的分组。然而，在茶叶等复杂植物基质中，大量共洗脱现象和结构相似代谢物的高丰度仍可能使特征分组和注释复杂化。此外，广泛使用的代谢组学平台（包括XCMS、MS-DIAL和MZmine）提供稳健的峰检测和注释功能，但其标准工作流程中并未明确关注ISFI识别。在此背景下，将系统化ISFI处理纳入数据预处理有望提高茶叶代谢组学的注释可靠性。 挥发性与非挥发性化合物均对茶叶品质有贡献。然而，本研究聚焦非挥发性代谢物，因为它们是GB/T 18650–2008标准下与滋味相关的商业分级的主要化学基础。此外，非挥发性代谢物非常适合基于UHPLC–HRMS的非靶向分析，为系统化ISFI处理的应用提供了适宜的分析背景。这一聚焦也有助于识别与XHLJT鉴别相关的化学标志物。 本研究将ISFI识别增强的非靶向代谢组学工作流程应用于探究地理来源和商业等级对XHLJT非挥发性代谢物谱的影响。具体而言，研究人员采用AntDAS-LCHRMS平台，在谱库匹配之前将系统化ISFI识别纳入UHPLC–HRMS数据处理，旨在减少注释歧义并提高鉴定可靠性。随后将所得注释用于对采集自四个核心产区、涵盖三个商业等级的XHLJT样本进行化学计量学判别。本研究为茶叶代谢组学的数据处理提供了面向应用的改进，并为GI框架内XHLJT来源和等级鉴别提供了化学证据。

论文解读

一、研究背景与问题

西湖龙井绿茶（Xihu Longjing green tea，XHLJT）作为地理标志（geographical indication，GI）产品，其感官品质和生物活性成分（儿茶素、黄酮类、生物碱、有机酸等）备受市场推崇。在GI体系内，西湖产区涵盖狮峰（SF）、龙井（LJ）、云栖（YQ）、虎跑（HP）、梅家坞（MJW）等核心产区，商品茶则依据综合品质被划分为特级（SG）、一级（1G）和二级（2G）。由于XHLJT价格显著高于普通绿茶，可靠的地理来源与等级鉴别对消费者保护和市场监管至关重要，但错误标签和掺假问题仍然频发。

当前XHLJT等级划分主要依赖专家感官审评，存在主观性和评审组间差异等局限，且缺乏对品质分子基础的化学可解释性。基于超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC–HRMS）的非靶向代谢组学虽已成为茶叶表征的重要策略，但面临两大瓶颈：一是茶叶中大量结构相似的多酚类衍生物产生相似MS/MS谱图，导致数据库注释歧义；二是茶叶特异性标准品有限，制约可靠鉴定。此外，电喷雾电离过程中的源内碎裂会产生源内碎片离子（in-source fragment ions，ISFIs），若未系统识别并关联至对应前体，会被误判为独立代谢物，导致特征表膨胀并损害下游分析。现有主流代谢组学平台（XCMS、MS-DIAL、MZmine等）虽具备稳健的峰检测和注释功能，但标准流程中未明确关注ISFI识别。因此，将系统化ISFI处理纳入数据预处理，有望提高复杂茶叶基质中的代谢物注释可靠性，从而为XHLJT来源和等级鉴别提供更客观的化学证据。

二、研究内容与意义

研究人员开发并应用了基于ISFI识别增强的非靶向代谢组学工作流程，系统探究地理来源和商业等级对XHLJT非挥发性代谢物谱的影响。该研究的意义在于：第一，为茶叶代谢组学数据处理提供了面向应用的改进方案，显著提升注释覆盖率和可靠性；第二，为GI框架内XHLJT的地理来源和品质等级鉴别提供了客观的化学标志物证据，有助于市场监管和消费者权益保护。

三、主要技术方法

研究人员采用AntDAS-LCHRMS公开平台对UHPLC–HRMS数据进行预处理，包括提取离子色谱（EIC）构建、峰检测、保留时间校正和特征注册。在此基础上实施专门的ISFI识别算法，基于色谱轮廓相似性（>0.95）对MS¹特征聚类，通过精确质量关系和共洗脱相似性（r≥0.975）将同位素离子、加合离子、中性丢失离子和源内碎片离子归并为同一化合物的复合MS¹谱，作为伪MS/MS谱进行谱库匹配。统计与化学计量学分析采用单因素方差分析（ANOVA，p<0.05）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA，VIP>1）和层次聚类分析（HCA）。样本队列来源：55个2024年春季明前XHLJT样本，来自西湖产区四个核心区域（SF、YQ、HP、MJW），涵盖三个商业等级，另采集18个2026年样本用于跨年度外部验证。

四、研究结果

4.1 基于来源分组的工作流程评估

研究人员以地理来源分组评估了工作流程的稳健性。QC样本峰面积RSD≤30%的特征占比超过80%，经QC过滤（RSD>30%剔除）和检出频率过滤（<60%剔除）后保留10723个高置信特征，ANOVA筛选出8913个来源相关差异特征。PCA显示四个地理来源清晰分离，QC样本紧密聚集于中心，验证了仪器稳定性和预处理流程的可靠性。

在化合物鉴定能力评估中，ISFI工作流程将8913个差异MS¹特征整合为5431个化合物级MS¹谱（SpecIDs），其中2777个（51.13%）具有实验MS/MS谱。重建MS¹谱与实验MS/MS谱联合库匹配返回812个SpecIDs，较传统特征级流程（仅匹配500个特征）提升62.4%。传统流程中仅79.8%的鉴定特征对应[M+H]⁺，其余为加合物或源内碎片，增加误注释风险。以特征7为例，ISFI工作流程通过整合重建MS¹谱和MS/MS谱证据，可靠鉴定为山柰酚-7-新橙皮苷（kaempferol-7-neohesperidoside），而传统流程将相关前体离子错误归属为山柰酚-7-O-葡萄糖苷和山柰酚。最终共鉴定57个差异化合物。

4.2 来源相关非挥发性代谢物的筛选与鉴定

研究人员在控制等级效应的前提下，对每个等级内（SG、1G、2G）四个来源（SF、YQ、HP、MJW）进行比较。经QC过滤和检出频率过滤后，ANOVA分别保留8862、9022和9245个差异特征。无监督PCA在每个等级内均显示四个来源清晰分离。ISFI工作流程分别重建5455、5605和5761个化合物级MS¹谱，经库匹配和人工验证分别鉴定47、43和44个差异化合物。OPLS-DA进一步增强来源间分离，置换检验确认模型稳健性。VIP>1筛选出SG、1G、2G中分别14、15和15个潜在来源判别代谢物，箱线图验证了多数判别代谢物的来源依赖性丰度差异。HCA热图显示同一来源样本在各等级内聚集，来源依赖性代谢物模块呈现协调上/下调。

化学分类分析显示，来源判别代谢物主要分布于氨基酸及其衍生物，黄酮类和生物碱次之，多酚类和其他类别占比较小。跨等级交集分析确定了三个核心地理标志物：可可碱（theobromine）、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷（luteolin-4′-O-glucoside）和酪氨酸（tyrosine）。可可碱作为嘌呤生物碱和咖啡因生物合成中间体，反映遗传与环境因素的联合调控；木犀草素-4′-O-葡萄糖苷体现黄酮代谢对来源变异的贡献；酪氨酸表明游离氨基酸代谢是地理判别的重要因素。多数其他判别代谢物具有等级特异性，提示来源相关代谢特征并非完全跨等级稳定，来源鉴别应兼顾跨等级通用标志物和等级特异性代谢物。

4.3 等级相关非挥发性代谢物的筛选与鉴定

研究人员以来源为分组条件，对SF、YQ、HP、MJW内各等级（SG、1G、2G）进行比较。经过滤后，ANOVA分别保留6927、5609、7324和7150个差异特征。无监督PCA显示各来源内等级间清晰分离。ISFI鉴定分别注释41（SF）、18（YQ）、41（HP）和25（MJW）个等级判别化合物。OPLS-DA实现各来源内不同等级样本的清晰判别，VIP>1分别筛选出13、7、12和11个等级标志物，箱线图验证了多数标志物的等级依赖性丰度趋势。HCA热图揭示了跨等级的来源特异性代谢物积累模式。

化学分类分析表明，氨基酸及其衍生物在所有来源的等级判别代谢物中占主导地位。酪氨酸和谷氨酸在多个来源中一致作为等级标志物出现，与GB/T 18650–2008标准将游离氨基酸与高品质XHLJT的鲜味和新鲜感特征相关联一致。黄酮类呈现明显的来源依赖性贡献，在SF、HP和MJW中丰富但在YQ中基本缺失；核苷酸、生物碱、多酚和有机酸贡献较小且更具来源特异性。高等级样本中氨基酸富集与先前感官研究一致，表明茶氨酸及相关氨基酸显著贡献于优质龙井茶理想的鲜味和甜味；黄酮类和生物碱可能调节苦味和涩味，这些代谢物类别间的平衡构成XHLJT感知品质层级的基础。

4.4 跨年度验证与讨论

研究人员利用18个2026年采集的明前XHLJT样本进行外部验证，涵盖九个来源-等级组合。通过将2024年制备的合并QC样本与2026年样本一同重新分析，采用基于QC的校准方法对每个特征计算校正因子（CF_p = X?_p,QC,2024/X?_p,QC,2026），对2026年数据进行批间校正后，作为独立外部预测集导入2024年样本建立的OPLS-DA模型（不进行模型重拟合），评估模型的跨年度可转移性。

五、研究结论

本研究通过ISFI识别增强的非靶向代谢组学工作流程，系统阐明了地理来源和商业等级对XHLJT非挥发性代谢物谱的影响。ISFI工作流程显著提升了复杂茶叶基质中的代谢物注释覆盖率和可靠性，较传统特征级流程库匹配数量提升62.4%。地理来源在各级别中驱动系统性的代谢转变，可可碱、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷和酪氨酸被确定为跨等级通用的来源标志物；等级分化主要反映鲜味相关氨基酸的积累，酪氨酸被确定为唯一的等级判别通用标志物。该研究为茶叶代谢组学数据处理提供了方法学改进，并为GI框架内XHLJT的来源和等级鉴别提供了客观的化学证据基础。