智能手机辅助比率荧光传感：N, B共掺杂碳点用于次黄嘌呤现场检测与海产品新鲜度分级

《Food Chemistry: X》：Smartphone-assisted Ratiometric fluorescence sensing of hypoxanthine using N, B-co-doped carbon dots for on-site seafood freshness monitoring

　　

研究人员设计了基于N, B共掺杂碳点（N, B-co-doped carbon dots, N, B-CDs）的比率荧光传感器，用于次黄嘌呤（hypoxanthine, Hx）检测。级联酶反应生成2,3-二氨基吩嗪（2,3-diaminophenazine, DAP），在440 nm处猝灭N, B-CDs的蓝色发射，并在570 nm处产生荧光发射。智能手机辅助的RGB（red/green/blue）分析可实现无需仪器的可视化定量。化学接枝纸基传感器可实现便携式、现场海产品新鲜度评估。该平台可清晰区分新鲜、亚新鲜和腐败海产品样品。

海产品包括鱼、虾和贝类，营养丰富，但因水分活度高、内源自溶酶丰富、pH接近中性及多孔组织，极易腐败。及时、准确评估海产品新鲜度对食品安全、质量控制和消费者保护具有重要意义。常用新鲜度指标有总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen, TVB-N）、K值、总活菌数（total viable count, TVC）和次黄嘌呤（hypoxanthine, Hx）。TVB-N主要反映微生物腐败产生的碱性氮化合物积累，K值量化三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）相关嘌呤的降解程度，但二者准确定量通常需要复杂前处理或仪器检测。Hx作为ATP分解的终末嘌呤代谢物，在初始贮藏阶段开始积累，并在较长时期内持续增加，因此被认为是评估冷藏或常温贮藏下海产品渐进腐败的可靠标志物。新鲜海产品中Hx通常低于10 μM，腐败产品中超过50 μM。传统Hx检测依赖电化学方法、气相色谱-质谱（gas chromatography–mass spectrometry, GC–MS）和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）。HPLC和GC–MS可靠性及灵敏度较好，但设备昂贵、需要专业人员、样品前处理繁琐且有机溶剂消耗大；电化学方法虽较简单，却常在复杂食品基质中稳定性不足，并需频繁电极修饰和校准。因此，研究人员亟需开发简单、低成本、便携的实时Hx检测平台。荧光传感因灵敏度高、响应快、易用和样品消耗少而受到关注。比率荧光传感通过测量两个发射信号比值，可对探针浓度、激发强度和环境因素变化进行内置自校准，较单强度测量显著提高准确性和可靠性。碳量子点（carbon quantum dots, CQDs）具有可调荧光、良好光稳定性、低毒性、良好生物相容性和易合成等优点；杂原子掺杂可进一步提高荧光量子产率（quantum yield, QY）并引入表面官能团，改善选择性和传感性能。纸基传感器因低成本、可丢弃和所需设备少而适合现场应用。但已有Hx传感器仍存在若干问题：多数固态传感器依赖物理吸附，稳定性和重现性有限；单信号读出无法提供内置自校正；无需复杂计算、可直接对应海产品新鲜度状态的可视化分级策略较少；多数平台仅限溶液或纸基单一形式；跨多种海产品及时间依赖腐败动力学的验证仍有限。为此，研究人员报道了基于N, B-CDs的比率荧光传感器，用于Hx便携检测。其设计优势包括：通过戊二醛交联将N, B-CDs共价固定于滤纸，克服物理吸附稳定性限制；利用F₅₇₀/F₄₄₀比率读出提供内置自校正；建立经实验验证的R/B阈值，即新鲜<1.17、亚新鲜1.17–3.61、腐败>3.61，实现无需计算的即时视觉分级；同一传感化学同时提供溶液和纸基两种检测形式；在三种海产品基质上进行时间依赖腐败监测验证。检测机制为Hx与黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase, XOD）特异性酶反应生成H₂O₂，后者在辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）催化下与邻苯二胺（o-phenylenediamine, OPD）反应生成DAP。DAP通过内滤效应（inner filter effect, IFE）和静态猝灭（static quenching, SQ）有效抑制N, B-CDs在440 nm的蓝色发射，同时在570 nm产生明显橙色发射峰；两个发射信号比值与Hx浓度成正比，实现可靠定量。N, B-CDs还通过戊二醛交联固定于滤纸，制备可在紫外灯下视觉、免仪器检测的纸基平台。该平台成功用于实际海产品鱼、虾和蛤中Hx测定，具有理想选择性、灵敏度和回收率。研究目标为：合成高量子产率N, B共掺杂碳点；制备共价接枝纸基传感条；建立经智能手机验证的R/B视觉新鲜度分级阈值；开发溶液和纸基两种检测形式；在三种海产品基质上开展时间依赖腐败监测并与HPLC对照。

方法概括：研究人员采用一步水热法，以柠檬酸、尿素和硼酸合成N, B-CDs，并以相同条件制备未掺杂CDs、N-CDs和B-CDs作为对照，经透析纯化，以硫酸奎宁为参比测定QY。采用戊二醛交联将N, B-CDs共价接枝到滤纸。构建XOD-HRP-OPD级联酶反应体系，结合荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、X射线光电子能谱、傅里叶变换红外光谱、透射电子显微镜、动态光散射、X射线衍射、荧光寿命和Zeta电位进行表征。溶液和纸基检测均在优化pH 6、反应5 min条件下进行；纸基检测在365 nm紫外灯下用智能手机采集RGB并计算R/B。实际样品为武汉市中心超市购买的新鲜鱼、虾和蛤；另用90个独立样本，包括30个鱼、30个虾和30个蛤，于25 °C储存0–60 h，并以HPLC作为参考方法验证。

结果部分：
3.1 N, B-CDs的表征。通过透射电子显微镜观察，N, B-CDs呈球形且分散均匀，直径约2 nm；高分辨透射电子显微镜晶格间距为0.14 nm，对应石墨碳（100）面；X射线衍射在约23.5°出现宽峰，对应无定形碳（002）面，表明低结晶度和无定形结构。X射线光电子能谱显示C、N、O、B原子百分比分别为51%、4.68%、35.37%和8.95%，并识别出C–B、N–B、O–B、C–N等键，证实氮、硼成功共掺杂。傅里叶变换红外光谱显示O–H/N–H、C=O、C–O、N–H、C–N、O–B和C–B等振动，进一步验证掺杂。与B-CDs、N-CDs和未掺杂CDs相比，N, B-CDs的QY显著提高至12.89%，而B-CDs、N-CDs和未掺杂CDs分别为0.17%、1.36%和0.35%。紫外-可见吸收显示328 nm处n–π*跃迁；带隙计算为5.88 eV，未掺杂CDs为5.48 eV。
3.2 N, B-CDs的荧光性质与稳定性。在355 nm激发下，N, B-CDs在440 nm出现强发射峰，并表现激发依赖性，随激发波长从330 nm增至380 nm，发射峰逐渐位移，CIE色度图显示由蓝向蓝绿变化。研究人员评估了pH、离子强度、温度、紫外照射、交替紫外/暗条件和储存时间的影响。pH 3–9范围内，中性和碱性条件稳定，强酸性略降；NaCl浓度至800 mM时荧光强度仍高于初始80%；4–70 °C、连续紫外2 h、交替紫外/暗2 h及4 °C储存30天均保持稳定。上述结果表明N, B-CDs适合实际食品质量监测。
3.3 N, B-CDs分析Hx的机制。检测依赖两步级联酶反应：XOD选择性氧化Hx生成尿酸和H₂O₂；HRP催化H₂O₂氧化OPD生成DAP。DAP吸收与N, B-CDs的440 nm发射重叠，可猝灭蓝光并在570 nm发射橙光。对照实验显示，单独Hx、OPD、HRP或H₂O₂不显著影响N, B-CDs；无Hx的完整酶体系不产生570 nm峰；含Hx完整体系出现440 nm猝灭和570 nm新峰。反应混合物紫外-可见吸收在约448 nm出现DAP吩嗪生色团特征峰，无Hx或XOD时缺失。N, B-CDs+Hx+XOD+OPD+HRP混合物在404 nm出现新峰，且随Hx浓度增加而增强，表明DAP与N, B-CDs形成基态复合物。Stern–Volmer图在不同温度下线性良好，猝灭常数随温度升高而降低，支持SQ。DAP吸收与N, B-CDs发射重叠提示IFE或荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）可能参与；荧光寿命由6.51 ns变为6.55 ns，基本不变，排除FRET；Zeta电位均为负，排除静电吸引导致FRET。因此，440 nm猝灭归因于SQ主导和IFE次要的协同作用。
3.4 溶液中Hx检测。研究人员优化pH和反应时间。pH 6时F₅₇₀/F₄₄₀变化最大；反应5 min达到平台。Hx浓度从0增至250 μM时，440 nm发射逐渐降低，570 nm信号升高。F₅₇₀/F₄₄₀对Hx呈两段线性：0.1–15 μM和15–125 μM，检测限（limit of detection, LOD）为0.106 μM，定量限（limit of quantification, LOQ）为0.353 μM，均低于新鲜度损失关键阈值10 μM。RGB分析显示颜色由蓝向橙黄变化，R/B与Hx呈三段线性，LOD为0.072 μM，LOQ为0.240 μM。选择性实验表明，常见离子、氨基酸和其他小分子几乎不引起F₅₇₀/F₄₄₀显著变化，仅Hx引起显著上升，源于XOD对Hx的特异性识别。
3.5 N, B-CDs在实际样品中检测Hx。溶液法用于鱼、虾和蛤样品，测得Hx分别为13.34±0.86 μM、0.72±0.094 μM和1.25±0.16 μM，与HPLC结果接近。加标10 μM和70 μM时，回收率为99.00%–111.10%，相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）小于1.10%。鱼样10 μM加标回收率111.10%略高，采用基质匹配校准后改善为105.2%，证实主要来自鱼基质对荧光信号的影响；该偏差不影响新鲜度分类，因为R/B阈值10 μM和50 μM间隔较大。
3.6 纸基传感器的表征。研究人员通过戊二醛介导将N, B-CDs共价固定到纤维素滤纸：先用3 mol/L NaOH活化滤纸增加表面羟基，再浸入2%戊二醛乙酸缓冲液形成半缩醛，最后通过席夫碱形成亚胺键将N, B-CDs锚定。傅里叶变换红外光谱中，改性纸在1713 cm^-1出现N, B-CDs的C=O伸缩峰，而原始纸无此峰；紫外-可见吸收在约328 nm保留N, B-CDs特征；X射线光电子能谱显示接枝纸出现原始纸没有的N 1s和B 1s信号，高分辨谱与N, B-CDs一致，证明成功固定并稳定整合。
3.7 纸基传感器用于Hx检测。将不同浓度Hx、XOD、OPD和HRP依次滴加至N, B-CDs接枝纸条，5 min后在365 nm紫外灯下拍照。Hx从0增至225 μM时，纸条荧光由亮蓝逐渐变为橙黄；R/B与Hx呈四段线性：0.1–1 μM、1–25 μM、25–100 μM和100–225 μM；LOD为0.128 μM，LOQ为0.427 μM。选择性实验显示仅Hx引起明显蓝到橙黄变化，其他干扰物影响可忽略。10条独立制备纸条显示批内重现性良好。根据Hx临界水平，纸基传感器建立新鲜度分级：R/B<1.17为新鲜，Hx<10 μM或<0.034 mg/g；R/B 1.17–3.61为亚新鲜，Hx约10–50 μM或约0.034–0.17 mg/g；R/B>3.61为腐败，Hx>50 μM或>0.17 mg/g。对90个独立海产品样本验证，总体分类准确率为91.1%，新鲜、亚新鲜和腐败检测灵敏度分别为90.0%、86.7%和96.7%，R/B与HPLC测定Hx浓度相关性R²=0.971。室温约25 °C储存0、10、20、30、40和60 h时，鱼、虾和蛤的R/B均随时间增加，反映Hx积累；鱼在相同条件下腐败速度和Hx积累明显快于虾和蛤。纸基平台可清晰区分新鲜样品与储存20 h及以上样品，实现免仪器视觉读取。

讨论与结论部分总结：作者将本平台与已有系统比较，指出其特点包括：同一传感策略同时提供溶液和纸基两种格式；首个建立并验证视觉新鲜度分类阈值的纸基比率Hx传感器；共价固定策略提供优于多数物理吸附传感器的储存稳定性，30天后仍>95%；纸基形式仅需4个操作步骤、5 min响应时间；且在三种不同海产品上完成时间依赖腐败动力学验证。研究结论翻译如下：综上所述，研究人员构建了一种智能手机辅助的基于N, B-CDs的比率荧光传感平台，用于选择性、灵敏地定量Hx。检测机制涉及XOD催化Hx氧化产生H₂O₂，随后触发HRP催化OPD氧化生成DAP。DAP通过静态猝灭和内滤效应有效抑制N, B-CDs在440 nm处的蓝色发射峰，而DAP在570 nm处产生橙色荧光，从而实现比率读出。溶液基和纸基两种形式均表现出理想分析性能，线性范围分别为0.1–125 μM和0.1–225 μM，检测限分别为0.106 μM和0.128 μM，完全覆盖海产品腐败相关关键Hx浓度区域。两种形式对常见干扰物均具有理想选择性，在鱼、虾和蛤样品中获得满意回收率（99.00–111.10%，RSD<1.10%），结果与HPLC相关良好。更重要的是，化学接枝纸传感器基于实验验证的R/B比值阈值实现直接、可视化新鲜度分级：<1.17为新鲜，1.17–3.61为亚新鲜，>3.61为腐败，与公认水产品Hx阈值10 μM和50 μM吻合良好。以HPLC参考测量对90个独立海产品样品验证，总体分类准确率为91.1%。海产品时间依赖性腐败监测证实，该传感器可提供可靠、快速、现场新鲜度筛查。凭借低成本、用户友好操作和最低设备需求，该平台有望赋能消费者和检查人员在资源有限环境中进行实时食品质量评估。