Dioscin通过TGF?β2/PI3K/Akt/β?catenin通路减轻D?半乳糖诱导的视网膜色素上皮细胞衰老与上皮–间质转化：AMD样模型中脉络膜血管内皮细胞来源TGF?β2的潜在旁分泌机制

《PLOS One》：Dioscin attenuates D?galactose?induced retinal pigment epithelium senescence and epithelial–mesenchymal transition via the TGF?β2/PI3K/Akt/β?catenin pathway

　　

摘要
目的 本研究旨在评估Dioscin在年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）样模型中的保护作用，并探索其潜在治疗机制。
方法 研究人员利用D?半乳糖（D?galactose）诱导的ARPE-19细胞（体外初步筛选模型）和C57BL/6J小鼠衰老模型，通过RT-qPCR、western blotting、免疫荧光（immunofluorescence，IF）和衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated-β-galactosidase，SA-β-gal）染色研究Dioscin对AMD的治疗潜力。生物信息学分析和分子对接确定TGF-β2（transforming growth factor-beta 2，TGF-β2）为Dioscin在AMD中计算预测的潜在靶点。在体外通过RT-qPCR和western blotting评估涉及TGF-β2与PI3K/Akt/β-catenin信号通路的关键机制。
结果 在D?半乳糖诱导的衰老模型中，Dioscin显著减轻视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）衰老和上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）。单细胞转录组分析显示，TGF-β2在AMD患者脉络膜血管内皮细胞中高表达。机制上，计算预测（分子对接和动力学模拟）确定TGF-β2为Dioscin的计算预测潜在靶点，实验数据显示Dioscin抑制D?半乳糖诱导的RPE细胞中TGF-β2/PI3K/Akt/β-catenin通路激活，提示潜在旁分泌（paracrine）调节机制。
结论 Dioscin通过抑制TGF-β2/PI3K/Akt/β-catenin通路减轻RPE衰老和EMT。单细胞转录组学揭示TGF-β2在AMD脉络膜血管内皮细胞中特异性上调，提示连接血管病理与RPE功能障碍的旁分泌机制。这些发现提示Dioscin在AMD样模型中减轻RPE衰老和EMT方面可能具有潜在价值，尽管仍需在更临床相关的AMD模型中进一步验证。

一、研究背景与问题
年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是老年人不可逆视力丧失的主要原因，特征为视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）进行性功能障碍和变性。早期干性AMD主要由RPE细胞衰老和上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）驱动，但针对这些核心病理过程的有效药物干预仍有限。AMD临床上分为地图样萎缩（geographic atrophy，GA）和渗出型。RPE功能完整性对维持视网膜稳态至关重要。早期RPE已出现脂褐素积累、吞噬能力受损和氧化应激损伤；GA中RPE从早期功能障碍进展为萎缩和死亡，导致覆盖其上的光感受器继发变性和地图样萎缩区形成；渗出型中RPE屏障功能受损触发异常脉络膜新生血管，导致出血和液体渗漏。当前治疗包括抗血管内皮生长因子（anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF）玻璃体腔注射、皮质类固醇植入物联合治疗、基于AREDS和AREDS2配方的营养补充，以及补体C3通路靶向抑制等，但功能获益和长期疗效仍有限，需要具有多样作用机制的新药物。Dioscin（薯蓣皂苷）是天然甾体皂苷，主要存在于Paris polyphylla和Polygonatum species等药用植物中，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗衰老等药理活性。AMD同样涉及慢性氧化应激、炎症和RPE衰老，但Dioscin在AMD中的作用尚未被探索。此外，AMD中脉络膜血管微环境与RPE细胞间的调控互作尚未完全阐明，TGF-β2在该细胞间通讯中的作用也未完全明确。因此，研究人员采用D?半乳糖（D?galactose，D?gal）诱导的体内外衰老模型，评估Dioscin对RPE衰老和EMT的保护作用，并通过整合生物信息学分析、分子对接和实验验证，探究TGF-β2是否连接脉络膜血管病理与RPE功能障碍，以及Dioscin是否靶向转化生长因子-β2/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/β-连环蛋白（TGF-β2/PI3K/Akt/β-catenin）轴。该研究的意义在于为AMD提供潜在天然化合物候选，并提出TGF-β2作为血管-RPE通讯桥梁的概念。

二、关键技术方法
研究人员建立D-gal诱导的C57BL/6J小鼠AMD样RPE衰老模型和ARPE-19细胞体外初步筛选模型。样本队列来源包括GSE29801（50例正常和41例AMD黄斑RPE-脉络膜转录组）和GSE183320（10例健康供体和11例AMD患者黄斑脉络膜单细胞RNA测序）。关键技术包括RT-qPCR、western blotting、免疫荧光、SA-β-gal染色、H&E染色、MTT、伤口愈合和transwell实验；生物信息学差异表达与GO富集、STRING/Cytoscape PPI和MCODE模块分析；PharmMapper预测Dioscin靶点，GeneCards获取AMD相关基因；AutoDock Vina分子对接和GROMACS分子动力学模拟。

三、研究结果
3.1 Dioscin ameliorates D?gal-induced senescence in C57 mice
研究人员在D-gal诱导衰老C57小鼠中观察Dioscin作用。D-gal显著降低体重，Dioscin恢复体重变化。H&E显示D-gal引起RPE层排列紊乱、单层完整性丧失和局部RPE变薄，Dioscin共处理保留RPE单层结构。SA-β-gal阳性细胞在D-gal组增加，Dioscin逆转。RPE/脉络膜和视网膜中p16、p21 mRNA上调，Dioscin抑制；免疫荧光显示p16蛋白升高，Dioscin减弱。结论：Dioscin减轻D-gal诱导的小鼠RPE衰老，可能对AMD有潜在治疗价值。

3.2 Dioscin influenced epithelial-mesenchymal Transition in C57 mice
通过免疫荧光评估Vimentin、N-cadherin、E-cadherin。D-gal诱导EMT表型，Vimentin上调、E-cadherin下调；Dioscin共处理恢复E-cadherin、降低Vimentin。Dioscin单独抑制基础Vimentin但不影响E-cadherin。qPCR确认Vimentin和N-cadherin mRNA在D-gal后升高，Dioscin抑制。结论：Dioscin在蛋白和转录水平减轻小鼠RPE的D-gal诱导EMT。

3.3 Dioscin ameliorates D?gal induced senescence in ARPE-19 cells
建立ARPE-19 D-gal衰老模型。MTT确定2 mM D-gal、2 μM Dioscin、20 μM VitD3非细胞毒。SA-β-gal阳性细胞在D-gal组增加，Dioscin或VitD3逆转。免疫荧光p16升高，Dioscin逆转。Western blot显示p16、p21、MMP1上调，Dioscin或VitD3抑制。结论：D-gal诱导ARPE-19衰老，Dioscin减轻。

3.4 Dioscin influenced epithelial-mesenchymal Transition in ARPE-19 cells
伤口愈合和transwell显示D-gal促进ARPE-19迁移和侵袭，Dioscin减弱；Dioscin单独无固有作用。RT-qPCR和Western blot显示D-gal上调N-cadherin、Vimentin，下调E-cadherin，Dioscin逆转。结论：Dioscin通过调节EMT标志物抵消D-gal增强的细胞运动，恢复上皮表型。

3.5 Bioinformatic analysis suggests TGF?β2 as a potential mediator linking Dioscin to AMD pathogenesis
用GSE29801分析AMD与正常黄斑RPE差异表达，鉴定116个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），71上调、45下调。GO富集于“response to vitamin”“response to nutrient”、含胶原细胞外基质、肝素/糖胺聚糖结合等。PharmMapper预测Dioscin潜在结合蛋白391个；PPI MCODE得到三个子网“Immune Microenvironment & Tissue Remodeling”“WNT Signaling”“Neuroendocrine Peptide Messengers”；与GeneCards AMD相关基因交集，TGF-β2位于“Immune Microenvironment & Tissue Remodeling”子网。结论：生物信息学提示TGF-β2可能是Dioscin影响AMD的潜在介质。

3.6 Molecular docking and molecular dynamics identify TGF?β2 as a putative binding target of dioscin
分子对接显示Dioscin与TGF-β2（PDB ID: 6I9J）结合，最低结合能?7.9 kcal/mol，可能与ASN405、MET406、CYS350、SER377、SER404、TYR341残基相互作用。50 ns分子动力学显示TGF-β2 C-alpha RMSD前5 ns上升，10 ns后稳定于2.0–3.5 ?；核心域310–350和375–390波动低，柔性环355–375波动高。结论：TGF-β2为Dioscin计算预测的潜在靶点。

3.7 Dioscin suppresses D?gal-induced activation of the TGF?β2 and PI3K/Akt/β?catenin pathway
在D-gal诱导RPE细胞中，D-gal上调TGF-β2、PI3K、Akt、GSK-3β mRNA，Dioscin逆转。Western blot显示D-gal增强PI3K和Akt磷酸化，增加TGF-β2、PKC、GSK-3β和β-catenin蛋白，Dioscin使这些变化正常化。结论：Dioscin抑制D-gal诱导的TGF-β2和PI3K/Akt/β-catenin轴激活。

3.8 TGF?β2 expression is elevated in arterial endothelial cells and choriocapillaris endothelial cells of AMD patients
分析GSE183320单细胞转录组。质控和聚类识别9种细胞类型，AMD组动脉内皮细胞比例升高。TGF-β2主要表达于脉络膜毛细血管内皮细胞、动脉内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞；与对照相比，AMD患者脉络膜毛细血管和动脉内皮细胞中TGF-β2显著上调。结论：血管内皮细胞是AMD中TGF-β2失调的关键位点，提示脉络膜血管与RPE之间潜在旁分泌信号轴，可能传递病理信号诱导RPE衰老和EMT。

四、讨论与结论
讨论部分显示，Dioscin为天然甾体皂苷，在体内外D-gal模型中抗RPE衰老和EMT，机制为抑制TGF-β2介导的PI3K/Akt/β-catenin信号通路；单细胞转录组显示TGF-β2在AMD脉络膜血管内皮细胞特异上调，提示脉络膜血管与RPE之间旁分泌信号轴。Dioscin已知在其他系统有抗衰老、抗炎、抗EMT作用，如经RAGE/NOX4缓解阿尔茨海默病，经Akt/GSK3β/β-catenin抑制骨肉瘤干性和EMT，经AKT/GSK3β/mTOR抑制肺腺癌EMT；因此本研究并非声称全新机制，而是将这些已知药理作用扩展至RPE衰老和AMD样背景，新贡献在于识别TGF-β2作为潜在血管来源旁分泌介质。D-gal模型不能完全复现人AMD的全部病理谱，包括玻璃膜疣（drusen）形成和补体激活，应解释为AMD样RPE衰老模型而非临床AMD完全替代；但该模型捕捉早期干性AMD关键特征：RPE层紊乱、p16/p21/SA-β-gal上调、EMT样表型。ARPE-19亚融合培养不反映原代RPE极化状态，但为公认初步机制验证系统；体内外结果一致性增强有效性。单细胞数据显示TGF-β2主要在脉络膜毛细血管和动脉内皮细胞表达且升高，而非RPE细胞本身；鉴于脉络膜血管与RPE单层经Bruch膜解剖邻近，研究人员提出脉络膜内皮细胞分泌的TGF-β2可能旁分泌作用于RPE。体外D-gal可上调RPE细胞TGF-β2，Dioscin抑制该上调，提示RPE也可响应并产生TGF-β2，形成潜在前馈环路。PI3K/Akt是衰老和EMT中心调节通路，TGF-β2可激活PI3K/Akt促进RPE EMT；D-gal诱导PI3K/Akt磷酸化、PKC和GSK-3β升高、β-catenin稳定，Dioscin抑制整个网络。局限包括：D-gal模型不完整，未来需NaIO₃或遗传AMD模型验证；体内缺阳性对照和AMD相关功能终点（OCT、ERG、RPE flat mount），数据应解释为减少RPE衰老样表型而非证明AMD保护；旁分泌假说需共培养或内皮特异性TGF-β2敲低直接检验；分子对接和动力学不证明直接结合，需SPR、CETSA或DARTS确认；未评估剂量反应和眼部药代，未来LC-MS/MS测RPE/脉络膜Dioscin；临床转化未知，生物利用度和长期安全性未建立。

结论翻译：总之，本研究表明Dioscin在体内和体外模型中减轻D?半乳糖诱导的RPE衰老和上皮-间质转化。机制上，研究人员表明Dioscin抑制衰老相关应激下激活的TGF-β2/PI3K/Akt/β-catenin信号轴。整合生物信息学分析（包括分子对接和动力学模拟）和单细胞转录组学进一步揭示，TGF-β2在AMD患者脉络膜血管内皮细胞中特异性上调，提示连接脉络膜病理与RPE功能障碍的潜在旁分泌信号机制。总之，研究人员的发现表明Dioscin在D?半乳糖诱导的AMD样模型中减轻RPE衰老和EMT。需要在临床相关AMD模型中进一步研究以评估其转化潜力。