《PLOS Biology》：Whole-organ single-cell mapping defines growth dynamics and clonal organization in developing and adult zebrafish livers
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脊椎动物器官在胚胎后期经历大规模生长。然而，由于无法在完整成体器官内监测不同类型个体细胞，研究人员对器官尺度生长过程在单细胞分辨率下的组织机制理解长期受限。本研究建立了一套整合全成体器官扩张显微术（WAO-ExM）的工作流程，能够在完整成体脊椎动物肝脏内实现每
脊椎动物器官在胚胎后期经历大规模生长。然而，由于无法在完整成体器官内监测不同类型个体细胞，研究人员对器官尺度生长过程在单细胞分辨率下的组织机制理解长期受限。本研究建立了一套整合全成体器官扩张显微术（WAO-ExM）的工作流程，能够在完整成体脊椎动物肝脏内实现每个肝细胞的原位单细胞分辨率可视化。利用转基因报告系统标记肝细胞核，研究人员量化了整个胚胎后期生长阶段的细胞扩增动态，发现完整成体肝脏厚度约5 mm，平均含有1,265,206个肝细胞。数据进一步揭示了非线性生长模式，细胞数量增加了538倍，且存在一个时间上集中的爆发期，该爆发期并不反映整体身体生长。将谱系示踪与WAO-ExM整合后发现，细胞数量增加由少数肝细胞在器官尺度上发生剧烈克隆扩增所驱动。细胞外基质层粘连蛋白的破坏使肝脏塑形与总细胞数增加脱偶联，提示组织架构与细胞增殖受独立调控。研究人员还利用WAO-ExM监测了病变肝脏及其他成体器官，包括心脏和胰腺。总之，这些发现将微米尺度的细胞行为与厘米尺度的器官生长联系起来，并建立了一个可推广的平台，使成体脊椎动物器官能够在真正的单细胞分辨率下被完整解析。
全器官单细胞分辨率成像揭示斑马鱼肝脏发育与成体生长动态及克隆组织结构
一、研究背景与科学问题
脊椎动物器官如肝脏和心脏在胚胎后期经历剧烈生长，表现为细胞数量显著增加以及器官大小和形状的明显变化。虽然早期胚胎器官形态发生可以在斑马鱼等小型脊椎动物模型中从细胞水平和器官水平进行研究，但在技术层面仍难以捕获后期发育阶段整个器官内单个细胞的行为。主要障碍包括有限的光学透明性，以及厚度超过约100 μm的厚组织样本难以进行细胞分辨率的体积成像。据研究人员所知，尚未对成体脊椎动物器官生长至最终毫米至厘米尺度大小和形状所需的细胞数量扩增进行定量评估。同样，细胞增殖如何与器官形态和功能在时空上协调也尚不清楚。因此，迫切需要能够在数千个细胞范围内同时提供真正的单细胞分辨率和完整器官视野的方法。
扩张显微术（ExM）与光片显微术的结合已成为大生物样本亚细胞结构成像的有力方法，可物理且各向同性地扩张标本，从而减少光散射并实现精细结构的光学成像。然而，三维空间扩张也显著增加了样本尺寸，这对传统共聚焦显微镜构成实际挑战，包括采集时间延长、光漂白以及物镜工作距离限制。与宏观成像光学整合时，光片显微术可以有效克服这些限制。尽管有这些进展，此类方法尚未被应用于在器官尺度上以单细胞分辨率和细胞类型特异性纵向解析成体脊椎动物器官的发育轨迹。
肝脏是最大的实体器官，可能含有成体状态最高的细胞总数。肝细胞是肝脏的主要功能细胞，占其质量高达80%。利用斑马鱼模型，已有研究报道肝脏生长主要由胚胎后期肝细胞增殖驱动，肝细胞数量从幼虫到成体阶段估计增加约900倍。值得注意的是，有研究利用整体成像和细胞谱系示踪技术进一步揭示，个体肝细胞祖细胞对这种生长有异质性贡献，一些肝细胞产生巨大优势克隆，到成体时占据腹叶的相当大部分。这一发现提示，少数选择性祖细胞/干细胞的巨大增殖可能是介导重要脊椎动物器官胚胎后期扩张的关键细胞生长机制。然而，这种保守而复杂的机制只有在整个器官水平并以足够分辨率观察细胞生长动态时才能被发现。
二、研究内容与主要结论
研究人员开发了WAO-ExM技术，旨在可视化斑马鱼肝脏胚胎后期生长阶段各代表时期的每个肝细胞。通过整合组织透明化、扩张、基于轴锥镜的贝塞尔光束光片显微术以及长工作距离激发和检测物镜，研究人员实现了跨越8.6×16.3×4.8 mm3三维扩张样本空间中单个肝细胞核信号的全肝视图。研究确定肝细胞数量从幼虫期（7 dpf）的2,352个增加到成体（3–6月龄）肝脏平均1,265,206个。与多色谱系示踪工具结合使用时，WAO-ExM成功捕获了腹叶中肝细胞优势克隆的出现，便于定量确定克隆大小和内部细胞数量。此外，研究人员在胚胎后期对细胞外基质成分lamb1a进行了遗传时间扰动实验，揭示肝脏叶形态发生严重受损但总肝细胞数量未改变，表明宏观器官塑形和微观细胞增殖受独立机制调控。最后，该平台可应用于确定癌性肝脏中肝细胞的精确数量，以及主要成体器官中的关键细胞类型，包括心外膜细胞和胰腺β细胞。
三、关键技术方法
研究人员建立了WAO-ExM平台，核心流程包括：利用CLARITY透明化方法结合丙烯酸钾水凝胶介导的组织膨胀步骤，将成体斑马鱼肝脏扩张4倍（体积增加约64倍），使整个器官光学透明；使用轴锥镜贝塞尔光束光片显微镜对扩张后完整肝脏进行体积成像，采集6×15个tile和2,443个z-step，约5小时完成，体素分辨率约0.81×0.81×2.45 μm3，对应4倍扩张后约200×200×600 nm的有效分辨率；每个成体肝脏产生约1.7 TB的体积数据集。对于7和21 dpf样本，由于肝脏太小无法独立解剖，研究人员对整体动物或躯干片段应用WAO-ExM以保持器官完整性，整个斑马鱼幼虫可扩张达10倍。图像处理采用Fiji进行分箱和拼接、CLIJ2进行GPU加速高通量过滤、Imaris进行可视化和定量分析。样本来源于台湾中央研究院斑马鱼核心设施。
四、研究结果
完整成体肝脏内肝细胞的原位可视化
研究人员首先利用2.8 kb fabp1a启动子生成稳定转基因品系Tg(fabp1a:H2A-mCherry; fabp1a:palm-mTurquoise)，荧光标记每个肝细胞的核和膜。通过系统调查7 dpf、21 dpf、42 dpf和3–6月龄成体个体中的7,115–52,015个肝细胞，发现虽然大多数肝细胞（约99%）是单核的，但胚胎后期生长中核异质性有微妙但渐进的增加。个体肝细胞体积在幼虫到成体转变过程中平均增加1.75倍。利用CLARITY透明化结合水凝胶膨胀，成体斑马鱼肝脏扩张4倍并变得光学透明。使用贝塞尔光束光片显微术进行体积成像，获得约1.7 TB的数据集，实现了整个三叶成体肝脏中单个肝细胞的明确单细胞分辨率成像。与透明化但未扩张的组织相比，扩张组织在z轴分辨率上有显著改善，便于精确三维计数每个肝细胞。
成体阶段肝细胞数量平均达到127万个
研究人员应用WAO-ExM可视化7、21和42 dpf以及3–6月龄成体样本中的个体肝细胞核。结果显示肝细胞数量在幼虫到成体转变过程中急剧增加538倍，从7 dpf的2,352个增加到每个成体个体平均1,265,206个。值得注意的是，虽然体标准长度在21到42 dpf之间仅增加约2倍，但总肝细胞数量在同一三周期间激增约34倍。研究人员将此时期视为肝脏大量生长的关键阶段，这种生长从外部整体外观并不明显。通过定义生长个体中肝细胞的绝对数量，证明肝脏生长不是渐进的，而是在三周发育窗口内显著加速。
肝脏生长爆发期与优势肝细胞克隆的出现同时发生
研究人员生成了基于Brainbow的转基因品系和诱导型Cre品系，实现胚胎后期生长期间个体肝细胞及其克隆后代的长期追踪。该双转基因品系称为liverbow。在7 dpf、42 dpf和成体阶段未检测到泄漏Cre活性。在4 dpf添加多西环素和他莫昔芬可诱导幼虫肝细胞的稳健多色条形码标记。幼体和成体肝脏中优势肝细胞克隆的出现非常明显，尤其在腹叶和远端尖端区域，在35个成体肝脏中的34个中捕获到。通过滴定降低Cre活性使仅少数肝细胞被标记，研究人员对仅含单个标记肝细胞克隆的腹叶应用WAO-ExM。通过调查四个优势克隆，确定4 dpf标记的单个肝细胞到42 dpf可产生整个腹叶的24.9%，对应12,421个细胞（平均12.7%和6,602个细胞）。研究人员得出结论，与胚胎肝细胞祖细胞类似，胚胎后期肝细胞的增殖能力并不均等，而是细胞亚群选择性地在空间限制方式下剧烈扩增，可能解释了短时间窗口内肝细胞数量的急剧爆发。
层粘连蛋白活性主要影响肝脏形状而非总细胞数
研究人员利用温度敏感型lamb1asde1突变等位基因在活体斑马鱼中实现时间控制的实时层粘连蛋白失活，特别是在爆发生长期。三周lamb1a失活对整体鱼生长无明显影响，但约三分之一的突变鱼出现严重肝脏形态缺陷，包括完全失去一个主要叶或叶生长不成比例。利用WAO-ExM，研究人员发现尽管存在明显形态缺陷，突变肝脏与对照同胞之间的总肝细胞数量无显著差异（195,242对187,970个细胞）。这一意外发现表明层粘连蛋白可能主要通过调节整体器官塑形过程而非控制肝细胞增殖来影响肝脏生长和发育。如果没有WAO-ExM，研究人员将无法将宏观器官水平缺陷与器官内精确总细胞数的微观变化脱偶联。
成体斑马鱼癌性肝脏、心脏和胰腺的原位可视化
研究人员将WAO-ExM应用于肝脏癌症模型Tg(fabp10a:tert; p53?/?)，发现21 dpf转基因鱼表现出发育延迟迹象。WAO-ExM揭示这些已建立的细胞水平组织学异常伴随转基因动物中报告基因阳性肝细胞核数量比年龄匹配野生型对照低66%（23,049对7,769）。虽然初步且看似反直觉，但这些发现展示了WAO-ExM量化病变组织中器官范围细胞改变的能力。研究人员还将WAO-ExM应用于可视化覆盖心脏的每个心外膜细胞，确定成体心脏平均含有28,836个tcf21阳性心外膜细胞包围心室、心房和动脉球。原位可视化使研究人员进一步确定双层排列不仅限于心室，还延伸支持和包围整个成体心房和动脉球。此外，WAO-ExM还可应用于可视化并精确计数内分泌器官中的细胞，如成体个体初级胰岛中平均3,152个ins阳性胰腺β细胞。
五、讨论与结论
研究人员开发的WAO-ExM平台能够以单细胞分辨率和细胞类型特异性在厘米尺度体积内彻底检查完整成体脊椎动物器官。与谱系示踪技术结合，研究人员捕获并定义了优势肝细胞克隆在三维空间中的贡献。利用遗传工具扰动ECM活性揭示肝脏塑形过程和肝细胞扩增量并非内在耦合，而是独立调控。该平台可应用于疾病背景和其他成体器官，揭示只有在宏观和微观细节同时解析时才显现的器官水平细胞组织模式。
研究人员指出，X射线显微断层扫描（micro-CT）是另一种有力的原位成像方法，但依赖化学染色对X射线衰减的差异影响，难以解析染色对比度低的特定细胞群。Ueda研究组建立了基于CUBIC和光片显微术的框架，生成成体小鼠全器官单细胞分辨率的核中心图谱。WAO-ExM与斑马鱼研究社区丰富的转基因报告品系和遗传工具结合时，可提供简化、互补且多功能的平台。
研究还建立了分析TB级全器官数据集的规模化计算框架，整合Fiji、CLIJ2和Imaris的混合工作流，可在工作站级环境中高效处理数据。当前Imaris文件格式的局限性凸显了对新成像数据架构的需求，如基于Zarr规范的OME-NGFF标准，其分布式分块数据格式天然兼容并行和云原生计算框架。
由于研究聚焦于胚胎后期生长期，识别了与该发育期最相关的肝细胞增殖机制。未来研究需确定肝脏再生和成体稳态中是否采用类似的细胞生长策略，以及这些策略在肝脏疾病中如何被扰动。lamb1a的时间失活实验揭示肝脏形态发生和肝细胞数量增加不一定耦合，但胚胎后期肝脏形态变化与肠道弯曲过程时空相关，需进一步确定lamb1a对肝脏塑形的影响是直接的还是通过其对肠道和/或其他邻近器官形态发生的多效性影响间接作用。
总之，该研究整合组织透明化、扩张显微术、光片显微术、宏观光学和简化分析流程，实现了成体脊椎动物器官在真正单细胞分辨率下的体积解析。对时间集中生长阶段、优势克隆出现、器官形态与细胞增殖脱偶联以及器官特异性细胞模式的识别，突显了只有在原位视图完全跨越厘米和微米尺度维度时才能欣赏的复杂器官发生机制。
