《Advances in Sample Preparation》：A supramolecular solvent approach for internal exposome characterization in human serum: An exploratory proof-of-concept study in patients with serious mental illness
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化学暴露组涵盖个体一生中对外源性化学物质及其转化产物和相应生物学反应的累积暴露。其全面表征需要能够覆盖广泛化学空间的分析策略，而样品前处理是决定最终化学覆盖度的关键因素之一。超分子溶剂（SUPRAS）是由两亲分子在水相或水-有机介质中自发自组装和凝聚形成的纳米
化学暴露组涵盖个体一生中对外源性化学物质及其转化产物和相应生物学反应的累积暴露。其全面表征需要能够覆盖广泛化学空间的分析策略，而样品前处理是决定最终化学覆盖度的关键因素之一。超分子溶剂（SUPRAS）是由两亲分子在水相或水-有机介质中自发自组装和凝聚形成的纳米结构液体，其内部结构提供不同极性的微环境和多种溶质-溶剂相互作用机制，具备多位点配体萃取能力，可同时萃取理化性质差异极大的化合物。本研究首次将基于SUPRAS的广谱样品前处理方法应用于人血清内暴露组表征，结合靶向分析与高分辨质谱（HRMS）筛查。方法采用一步式蛋白沉淀与SUPRAS形成/萃取集成流程，以400 μL血清、400 μL四氢呋喃（THF）和200 μL 1-己醇组成优化体系（40:40:20，v/v/v），经涡旋和离心后直接进样分析。验证涵盖log D7.4从?1.7至7的代表性环境污染物、药物、兴奋剂等25种化合物，绝对回收率70–120%，基质效应89.6–120%，方法检出限（MDL）一般为0.3–7.2 μg L?1。将该方法应用于20份人血清样本（10份严重精神疾病（SMI）患者样本和10份健康对照样本）进行探索性概念验证。定量和筛查工作流程共检出5种环境污染物和13种药物、兴奋剂及药品。经Mann-Whitney U检验和Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正后，双酚S（BPS）和双酚A（BPA）在SMI组中浓度显著高于健康对照组（BPS中位数25.65 vs 0.34 μg L?1，pFDR=0.019，效应量r=0.79；BPA中位数30.05 vs 0.53 μg L?1，pFDR=0.046，r=0.62）。全氟辛酸（PFOA）和6:2氟调聚磺酸（6:2 FTSA）在两组中均有较高检出频率。补充筛查还检出对叔辛基苯酚、三环己基乙基酯等污染物以及26种药物、饮食相关化合物和代谢物。鉴于样本量有限，组间差异仅作为描述性趋势，不能推断群体水平结论。该SUPRAS-LC-QTOF-MS工作流程以极简的样品处理和低溶剂消耗实现了人血清中多种外源性化学物质的广谱覆盖，为未来大规模人群暴露组研究提供了可行的方法学基础。
论文解读
一、研究背景与意义
化学暴露组（exposome）概念涵盖个体一生中对外源性化学物质及其转化产物和生物学反应的累积暴露。全面表征暴露组需要分析策略覆盖极宽的化学空间，包括浓度范围差异巨大、理化性质迥异的各类化合物。尽管液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）技术的进步大幅扩展了化合物检测能力，样品前处理仍是决定最终化学覆盖度的关键限制因素。任何前处理阶段引入的选择性都可能导致特定化合物类别在仪器分析前损失。因此，化学暴露组学面临的核心挑战是开发能最大限度减少化学歧视、同时有效降低基质干扰并保持各类化合物满意回收率的样品处理方法。
人血清中的暴露组分析尤为困难：外源性化学物质通常处于痕量水平，而血清中高浓度蛋白质、脂类等内源性成分会造成分析干扰和基质效应。传统血清前处理方法主要包括蛋白沉淀（PPT）、液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）以及蛋白和磷脂去除（PLR）等，各有局限。PPT虽快速简便但需消耗数倍体积有机溶剂且基质去除有限；SPE和PLR虽能改善净化效果但操作步骤繁琐、溶剂消耗大、分析物损失风险高。已有比较研究显示，不同前处理策略对可检测化学空间影响显著，两种最终选定的方法之间仅43–54%的检测特征重叠。
超分子溶剂（SUPRAS）是两亲分子在水相或水-有机介质中自发自组装和凝聚形成的纳米结构液体，其内部结构提供不同极性微环境和多种溶质-溶剂相互作用机制，具备多位点配体萃取能力，可同时萃取宽理化范围化合物。部分醇类SUPRAS的内部结构还具备受限访问特性，可限制大分子和基质组分进入，从而将萃取和净化集成于同一溶剂系统。此前SUPRAS在人体生物液分析中的应用多为靶向特定化合物类别，如血清中苯丙胺类兴奋剂、非甾体抗炎药、双酚类化合物等。本研究首次将SUPRAS基广谱样品前处理方法专门用于人血清内暴露组表征，结合靶向分析和HRMS筛查，并在严重精神疾病（SMI）患者和健康对照样本中进行探索性概念验证。
二、主要技术方法
研究人员开发并优化了一步式SUPRAS-LC-QTOF-MS工作流程。样品前处理采用一步式方案，将400 μL血清、400 μL四氢呋喃（THF）和200 μL 1-己醇直接混合，涡旋1分钟促进蛋白沉淀、SUPRAS形成和分析物萃取同步进行，离心后取上层SUPRAS相直接进样，无需蒸发和复溶步骤。色谱分离采用超高效液相色谱（UHPLC）系统配C18色谱柱，质谱检测采用离子淌度-飞行时间质谱（TIMS-TOF），电喷雾电离（ESI）正负双模式采集。定量和靶向筛查采用宽带碰撞诱导解离（bbCID）模式，可疑物筛查采用数据依赖采集（DDA）自动串联质谱（MS/MS）模式。方法验证在加标马血清中进行，评估了THF比例、血清体积、盐析剂及一步式与两步式流程的影响。研究样本来自西班牙科尔多瓦雷纳索菲亚大学医院，共20份人血清样本，包括10份健康非吸烟者和10份诊断为严重精神疾病且吸烟的患者样本，经伦理委员会批准。
三、研究结果
SUPRAS处理条件优化
研究人员系统优化了SUPRAS组成和操作流程。THF含量是影响相分离和萃取效率的关键参数：一步式流程中20%和30% THF均无法形成清晰分离的SUPRAS上相，40% THF可获得明确的上相。两步式流程（先蛋白沉淀后SUPRAS萃取）在40% THF条件下68%分析物达到良好绝对回收率（70–91%），而一步式流程在相同THF条件下68%分析物达到非常好的绝对回收率（81–109%）。一步式流程所有分析物基质效应在89.6–120%之间，优于两步式流程。血清体积从200 μL增加至400 μL时萃取回收率保持相近范围，基质效应略有改善，最终选择400 μL以获得更高灵敏度。添加硫酸钠虽能提高多数化合物的绝对萃取效率，但显著恶化基质效应，因此最终方法不采用盐析剂。最优SUPRAS组成为40:40:20（v/v/v）THF:血清:1-己醇，一步式操作。
方法验证
校准曲线在SUPRAS中构建，浓度范围0.5–200 μg L?1，决定系数0.9369–0.9986。环境污染物方法检出限（MDL）一般为0.3–7.2 μg L?1，方法定量限（MQL）为0.9–24 μg L?1。磷酸三苯酯（TPP）和3-苯氧基苯甲酸因背景污染和电离效率低而具有较高检出限（MDL分别为46.9和30 μg L?1）。药物、药品和兴奋剂的MDL一般为0.3–3.75 μg L?1，MQL为1.0–12.5 μg L?1，劳拉西泮例外（MDL=30 μg L?1）。各验证水平下污染物准确度（相对回收率）为73–123%，日内精密度（RSD）为0.2–10%。部分药物在最低浓度水平出现偏差，提示需更合适的内标。
SMI患者血清内暴露组探索性分析
定量分析检出5种环境污染物和13种药物、兴奋剂及药品。环境污染物中位数浓度在健康对照（GP）组为0.3–2.7 μg L?1，在SMI组为0.5–30.1 μg L?1，检出频率从10%到90%不等。经Mann-Whitney U检验和Benjamini-Hochberg FDR校正后，双酚S（BPS）和双酚A（BPA）在两组间差异显著：BPS在SMI组中位数25.65 μg L?1，GP组0.34 μg L?1（pFDR=0.019，r=0.79）；BPA在SMI组中位数30.05 μg L?1，GP组0.53 μg L?1（pFDR=0.046，r=0.62）。全氟辛酸（PFOA）和6:2氟调聚磺酸（6:2 FTSA）在两组中检出频率均较高，中位数浓度与既往人血清生物监测研究同数量级。未检出农药残留，可能反映浓度低于方法检测能力。磷酸二苯酯（DPP）仅在1份GP样本中检出（2.4 μg L?1），TPP因背景信号干扰无法确证。
补充筛查工作流程进一步扩展了检出范围。可疑物筛查在对叔辛基苯酚在两组各2份样本中检出；靶向筛查检出三环己基乙基酯，在100% GP样本和30% SMI样本中检出。定量和筛查工作流程共检出26种额外药物、饮食相关化合物和代谢物。去甲地西泮在50% SMI样本中检出而GP组仅10%；吉非罗齐（40% vs 10%）和月桂基二乙醇胺（40% vs 20%）也呈现组间检出频率差异。加巴喷丁、奥美拉唑、4-三氟甲基苯酚、阿立哌唑、曲唑酮和去烷基氟西泮仅在SMI样本中检出。咖啡因在SMI组中位数（26.9 μg L?1）显著低于GP组（216.0 μg L?1），但未达统计学显著。尼古丁和可替宁仅在SMI样本中检出，与吸烟状态一致。地西泮和替马西泮在SMI组呈升高趋势但FDR校正后不显著。MDMA在1份SMI样本中检出（85.4 μg L?1）。可的松在两组所有样本中检出，中位数浓度相近（14.9 vs 15.8 μg L?1）。利他林酸（哌甲酯主要代谢物）在2份SMI样本中检出。
四、结论
本研究开发的SUPRAS基微萃取方法结合LC-QTOF-MS被证明是有效且多用途的人血清外源性化学物质多类别分析方案，以极低溶剂消耗（400 μL THF）和简单样品处理（400 μL血清、涡旋和离心）实现广谱化学覆盖。一步式净化/萃取集成策略提供了满意的萃取效率（70–120%）、可接受的基质效应和足够的多类别分析灵敏度。方法在可持续性方面具有优势，包括小型化、低样本和溶剂消耗、多步骤集成、温和操作条件以及消除蒸发和复溶步骤。在健康志愿者和SMI患者血清中检出广泛的环境污染物、药物、兴奋剂、饮食相关化合物和代谢物。两组间存在描述性差异，但样本量有限，不能推断群体水平结论。这些初步发现支持该工作流程在未来更大规模、恰当特征化队列研究中的应用，以调查人血清中的化学暴露特征。
