MT-CYB基因m.15045G>A变异及相关线粒体疾病的临床谱系与基因型-表型关联研究

《Frontiers in Neuroscience》：Clinical spectrum and genotype–phenotype correlations of MT-CYB-associated mitochondrial disease: from the m.15045G?>?A variant to the broader disease landscape

　　

中文摘要翻译 目的：阐明与MT-CYB基因m.15045G>A变异相关的临床和分子特征，并探讨MT-CYB相关线粒体疾病的临床谱系及基因型-表型关系。 方法：研究人员对携带m.15045G>A变异的患者进行了全面的临床、代谢、组织病理学、遗传学和线粒体功能分析。同时，对既往报道的疾病相关MT-CYB变异进行了系统性文献综述，随后进行基因型-表型比较，并结合临床、遗传和功能特征进行无监督层次聚类分析。 结果：该患者表现为运动不耐受、边缘智力功能以及中长链酰基肉碱水平升高。肌肉活检显示线粒体肌病样改变，呼吸链分析证实存在孤立的复合体III（CIII）缺乏。m.15045G>A变异在血液、尿液和肌肉组织中呈现组织特异性异质性，分别为22.5%、70.5%和95.5%，为其致病性提供了进一步证据。在34例携带疾病相关MT-CYB变异的患者中，线粒体肌病（MM）是最常见的表型（占50.0%）。MM患者的发病年龄较晚，且肌肉限制性变异在MM组中显著富集（p < 0.001）。相比之下，肌肉异质性水平、变异类型和孤立性CIII缺乏与表型无显著关联。层次聚类分析与临床表型分类的一致率达88.2%。 结论：本研究结果为m.15045G>A变异的致病性提供了进一步证据，并拓展了其相关的临床和代谢特征。MT-CYB变异的组织特异性分布与临床表型存在关联，而其他遗传和功能因素可能共同导致表型多样性。

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一、研究背景与研究目的

线粒体复合体III（CIII）由11个亚基组成，其中细胞色素b是唯一由线粒体基因组编码的亚基，由MT-CYB基因编码。MT-CYB基因变异可导致孤立性CIII缺乏，这是一种罕见的氧化磷酸化（OXPHOS）障碍，临床表现高度异质性，包括运动不耐受、心肌病、Leber遗传性视神经病变（LHON）和Leigh综合征（LS）等。尽管临床谱系广泛，但决定MT-CYB相关疾病表型多样性的因素仍不明确。特别是，变异特征、异质性水平、MT-CYB变异的组织分布以及生化异常对临床表型的贡献尚未被系统评估。此外，致病性MT-CYB变异极为罕见，且充分表征的患者数量有限，进一步阻碍了明确的基因型-表型关系的建立。MT-CYB基因m.15045G>A变异此前曾在一例成人孤立性线粒体肌病患者中被报道，但其致病性尚未得到充分证实。因此，本研究旨在通过报告第二例携带该变异的儿童患者，提供进一步的生化和功能证据确认其致病性，并通过系统性文献回顾全面描绘MT-CYB相关线粒体疾病的临床和变异谱系，探索与表型多样性相关的潜在因素。

二、主要研究方法

研究人员纳入了一例来自北京儿童医院的疑似线粒体病患儿，采集其外周血、尿液和肌肉组织样本。关键技术方法包括：肌肉活检并进行光镜和透射电镜（TEM）观察；采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）进行代谢谱分析；测定肌肉匀浆中线粒体呼吸链（MRC）复合体I、II、III、IV及联合复合体II+III的活性；从患者皮肤成纤维细胞提取线粒体，使用XF96海马生物能量分析仪测量耗氧率（OCR）；通过全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）及完整线粒体基因组测序进行遗传学分析；利用RNA测序（RNA-seq）评估成纤维细胞的异常基因表达和剪接事件；通过多序列比对和SWISS-MODEL平台进行蛋白结构建模和保守性分析；依据PRISMA指南对PubMed和EMBASE数据库进行系统性文献综述，最终纳入29篇文献共33例患者。

三、研究结果

1. 1.
   临床特征：先证者为一名12岁6个月女童，8岁时出现体重增长缓慢、进食时间延长、恶心呕吐及运动耐力下降。学业表现差，存在注意力、理解力和学习困难。体格检查示体重和身高位于低百分位。实验室检查示高乳酸血症（血乳酸4.79-6.42 mmol/L）。脑MRI显示大脑和小脑沟回增宽及巨大枕大池。韦氏智力测试显示总智商（FSIQ）为79，符合边缘智力功能。经L-肉碱、艾地苯醌、辅酶Q10、复合维生素B和肌酸等支持治疗6个月后，临床症状稳定，疲劳感略有改善。
2. 2.
   肌肉活检发现：肌肉活检显示线粒体肌病样改变。HE染色可见肌纤维直径轻度变异和嗜碱性颗粒变化；改良Gomori三色（MGT）染色显示大量破碎红纤维（RRFs）；琥珀酸脱氢酶（SDH）染色显示大量破碎蓝纤维（RBFs）；细胞色素c氧化酶（COX）-SDH联合染色显示COX活性保存，未见COX阴性纤维；油红O（ORO）染色显示许多肌纤维内中等量脂滴蓄积；透射电镜（TEM）显示肌纤维轻度萎缩，线粒体数量增加并有局灶性聚集，脂滴增多。
3. 3.
   代谢发现：血酰基肉碱谱显示多种中长链酰基肉碱（C6、C8、C10、C12、C14）升高，相关比值亦升高。尿有机酸分析显示乳酸显著升高，伴2-羟基丁酸、酮体、戊二酸和2-羟基戊二酸轻度升高。
4. 4.
   线粒体功能评估：患者成纤维细胞耗氧率（OCR）为健康对照的76.9%，虽在正常范围内但接近下限。骨骼肌线粒体呼吸链（MRC）酶分析显示孤立性CIII缺乏，CIII活性降至正常参考水平的约8.2%，经柠檬酸合酶（CS）和复合体II（CII）标准化后分别降至7.4%和7.7%，而复合体I、II、IV活性均在正常范围。
5. 5.
   遗传发现：全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）未发现核基因致病性变异。全长线粒体DNA测序在患者中发现一个异质性的MT-CYB变异m.15045G>A（p.Arg100Gln）。该变异在外周血、尿液和骨骼肌中的异质性水平分别为22.5%、70.5%和95.5%，在培养的皮肤成纤维细胞中约为35%。Sanger测序证实该变异存在于先证者，但在母亲的血和尿样本中未检出。根据2020年ACMG/AMP线粒体DNA变异规范，该变异被归类为可能致病性。
6. 6.
   保守性和结构分析：多序列比对显示Arg100在不同物种间高度保守。结构建模显示p.Arg100Gln突变导致局部电荷特性和侧链特征发生改变。
7. 7.
   文献综述：共纳入34例携带MT-CYB变异的个体。临床表型包括线粒体肌病（MM，50.0%）、非综合征性线粒体病（NSMD，26.5%）、线粒体心肌病（MCM，8.8%）、MELAS（8.8%）、Leigh综合征（LS，2.9%）和Leber遗传性视神经病变（LHON，2.9%）。运动不耐受是最常见的初始表现。错义变异最常见（58.8%），其次为无义变异（26.5%）、框内缺失（11.8%）和移码变异（2.9%）。90.0%的可评估病例为新发变异。骨骼肌异质性水平中位数为85%。
8. 8.
   基因型-表型关联分析：与non-MM组相比，MM组发病年龄显著更晚（10.5岁 vs 6岁，p=0.007），肌肉限制性MT-CYB变异比例显著更高（88.2% vs 6.3%，p<0.001）。non-MM组累及的器官系统数目显著更多（4个 vs 1个，p<0.001）。两组在性别、遗传模式、变异类型、肌肉异质性水平或孤立性CIII缺乏方面无显著差异。层次聚类分析与临床表型分类的一致率为88.2%。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究通过全面评估进一步确认了m.15045G>A变异的致病性，并扩展了MT-CYB相关线粒体肌病的临床和变异谱系。与先前仅表现为运动不耐受的成人患者不同，本病例还表现出边缘智力功能，这可能与该变异在神经组织的潜在分布或继发性全身代谢紊乱有关。研究强调，线粒体CIII缺乏可继发性损害脂肪酸β-氧化，导致酰基肉碱蓄积，这可能是MT-CYB相关CIII缺乏症的一个未被充分认识的代谢特征。通过对既往病例的系统回顾，研究表明MT-CYB相关疾病应被视为一个连续的临床谱系而非单一的肌病性疾病。研究发现组织特异性变异分布与临床表型之间存在显著关联，而肌肉异质性水平和变异类型与表型无显著关联。这些发现对临床管理具有潜在意义：对于肌病为主的患者，管理重点在于维持肌肉功能和运动耐量；而对于非肌病表型患者，需进行更广泛的监测，尤其是神经系统和心脏并发症。研究结论：本研究为MT-CYB基因m.15045G>A变异的致病性提供了进一步证据，并拓展了MT-CYB相关线粒体疾病的临床和代谢谱系。综合分析凸显了其广泛的表型异质性，并确定了MT-CYB变异的组织分布与临床表型之间的关联，即肌肉限制性变异在线粒体肌病患者中更为常见，而其他遗传和功能特征也可能共同参与表型表达。