《Frontiers in Neuroscience》：Multi-region social-emotional network underlying the effects of spine pinching therapy on empathy-like behavior in a rat model of autism spectrum disorder
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背景：捏脊疗法是孤独症谱系障碍（ASD）的一种有前景的替代疗法，但其对多区域分子协调的影响仍不清楚。本研究检测了捏脊疗法对前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中细胞 Fos 原癌蛋白（c-Fos）和催产素受体（OXTR）表达的影响，并进一步使用轮廓分析（profile
背景：捏脊疗法是孤独症谱系障碍（ASD）的一种有前景的替代疗法，但其对多区域分子协调的影响仍不清楚。本研究检测了捏脊疗法对前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中细胞 Fos 原癌蛋白（c-Fos）和催产素受体（OXTR）表达的影响，并进一步使用轮廓分析（profile analysis）分析这些脑区的表达模式，以探究改善社交和共情缺陷的多区域协调调控。方法：通过丙戊酸（VPA）诱导建立 ASD 大鼠模型。行为学测试后，研究人员将大鼠分为模型组（MG）、捏脊组（SPG）和空白对照组（BC）。SPG 自出生后第22天起接受15天干预。随后进行旷场实验（open field test）、三箱社交实验（three-chamber social test）和恐惧共情实验（fear empathy test）；采集脑组织进行免疫组织化学（immunohistochemistry）和蛋白质印迹（western blotting），并进行轮廓分析。结果：VPA诱导的 ASD 大鼠表现出发育缺陷和 ASD 样行为缺陷。与 BC 相比，MG 大鼠表现出社交和共情缺陷，且前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中 c-Fos 和 OXTR 水平降低。捏脊改善了这些 ASD 样行为缺陷。免疫组织化学显示，捏脊后三个脑区中 c-Fos 和 OXTR 表达显著增加。蛋白质印迹分析进一步支持这些发现，显示大多数脑区显著上调，其余脑区呈一致上升趋势。轮廓分析显示跨区域表达谱平行，提示多区域协调调控。结论：捏脊有效改善 ASD 大鼠核心 ASD 样行为缺陷，可能通过协调调控多区域社会-情绪网络实现。
研究背景与问题。孤独症谱系障碍（ASD）是一种病因复杂的神经发育障碍，临床表现为社交互动受损、兴趣狭窄以及重复刻板行为。近年来全球患病率呈上升趋势，全球疾病负担研究显示，2021年全球超过6180万人患有ASD，全球患病率约1/127；中国6—12岁儿童患病率约0.7%，估计0—14岁自闭症儿童可能超过200万。共情能力受损是ASD核心缺陷之一，导致理解他人情绪、准确解释社交情境和形成适当社交行为的多方面困难。镜像神经元系统（MNS，参与动作理解与情绪共鸣的神经网络）的发现为理解共情及相关社会认知的神经基础提供了重要理论依据，MNS通过“具身模拟”使个体理解他人行为意图和情绪状态。临床证据显示，ASD患者在完成模仿和观察情绪表情任务时，MNS相关脑区激活显著低于典型发育儿童。啮齿动物可表现社交和共情样行为，包括观察性恐惧和社交互动，这些行为依赖前额叶皮质（prefrontal cortex）、前扣带皮质（anterior cingulate cortex）、岛叶（insula）、下丘脑（hypothalamus）和杏仁核（amygdala）等脑区组成的神经环路，这些脑区与人类MNS存在解剖和功能同源及重叠，并在共情加工中协同发挥作用。捏脊疗法是传统中医外治法，首载于东晋葛洪《肘后备急方》，操作沿脊柱旁从长强穴（GV1）至大椎穴（GV14）连续捏提皮肤及皮下组织，重复至起效。中医认为脊柱与督脉相关，督脉与脑功能密切，捏脊刺激脊柱可激活督脉之气上充养脑，补髓益脑、开窍醒神，临床用于精神情绪障碍。前期研究组证实捏脊可改善ASD模型大鼠社交互动和认知行为，大椎穴推拿可升高ASD模型大鼠血清催产素表达。然而，既往研究多聚焦单一行为终点或单脑区分子变化，捏脊对多区域分子协调的影响尚不清楚。因此，研究人员采用多层级设计，结合发育表型、多维行为测试、区域特异性免疫组织化学和蛋白质印迹以及轮廓分析（profile analysis，用于比较跨区域表达曲线的方法），旨在更全面刻画捏脊改善ASD共情能力所涉及多个社会-情绪脑区的协调变化，并考察前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中细胞 Fos 原癌蛋白（c-Fos）和催产素受体（OXTR）表达及多区域协调模式。
研究开展与结论意义。研究人员以丙戊酸（VPA）诱导ASD大鼠模型，行为测试后分为模型组（MG）、捏脊组（SPG）和空白对照组（BC）；SPG从出生后第22天（PN22）起接受15天捏脊干预。随后进行旷场实验、三箱社交实验和恐惧共情实验，采集脑组织进行免疫组织化学和蛋白质印迹，并用轮廓分析评估多脑区协调。结果发现，VPA诱导ASD大鼠存在发育和ASD样行为缺陷；MG大鼠出现社交和共情缺陷，且前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中c-Fos和OXTR水平较BC降低；捏脊改善ASD样行为缺陷。免疫组织化学显示捏脊后三个脑区c-Fos和OXTR表达显著增加；蛋白质印迹进一步支持大多数脑区显著上调，其余脑区呈一致上升趋势；轮廓分析显示跨区域表达谱平行，提示多区域协调调控。结论认为，捏脊有效改善ASD大鼠核心ASD样行为缺陷，可能通过协调调控多区域社会-情绪网络实现。该研究意义在于从MNS相关社会-情绪网络出发，提供初步实验证据，支持捏脊通过协同调控前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中c-Fos和OXTR等关键蛋白表达及脑区间协调活动，改善ASD模型大鼠焦虑样行为、社交缺陷和共情损害。
主要关键技术方法。样本为Wistar大鼠，购自上海SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.，饲养于福建中医药大学动物实验中心。采用VPA诱导ASD模型，根据体重、睁眼、负趋地性、游泳和热板痛等发育评估和发育行为测试判断建模成功。行为测试后设MG、SPG和BC。SPG自PN22起每日1次、每次21遍、连续15天捏脊，从GV1沿中线至GV14，每3次提皮1次。行为学包括旷场实验、三箱社交实验和恐惧共情实验。脑组织采用免疫组织化学和蛋白质印迹检测前额叶皮质、下丘脑和杏仁核c-Fos和OXTR表达。轮廓分析采用重复测量一般线性模型，进行平行性检验、水平检验和平坦性检验；统计使用SPSS 27.0和GraphPad Prism 10。
3.1 产前VPA暴露对大鼠发育的影响。通过体重、睁眼、负趋地性、游泳和热板痛测试，研究人员发现与对照组相比，VPA暴露组在PN7、PN14和PN21体重显著降低，PN15和PN16睁眼评分显著降低，PN7、PN8、PN9和PN10负趋地性任务耗时显著增加，PN9、PN11、PN13和PN15游泳评分显著降低，PN9、PN11、PN13和PN15热板痛阈升高。结论为VPA暴露组存在生长发育延迟、前庭功能受损、运动协调和耐力降低以及痛敏感性降低，符合VPA诱导ASD模型已建立的发育和感觉运动表型。
3.2 捏脊对ASD大鼠行为的影响。通过旷场实验、三箱社交实验和恐惧共情实验，研究人员发现与BC相比，MG总移动距离、中央区进入次数和直立次数显著减少，梳理次数显著增加；与MG相比，SPG总移动距离、中央区进入次数和直立次数显著增加，梳理次数显著减少，提示捏脊缓解焦虑样行为并增强探索驱动力。三箱社交实验中，MG社交指数较BC显著降低，SPG较MG显著升高，提示捏脊改善社交缺陷并增强社交主动性。恐惧共情实验中，MG冻结行为持续时间较BC显著减少，SPG较MG显著增加，提示模型大鼠情绪共情受损，捏脊可在一定程度上增强ASD模型大鼠共情能力。
3.3 捏脊对ASD模型大鼠不同脑区c-Fos和OXTR的影响。通过免疫组织化学和蛋白质印迹，研究人员检测前额叶皮质、下丘脑和杏仁核。免疫组织化学显示，与BC相比，MG上述三个脑区c-Fos平均光密度（MOD，即积分光密度/面积）显著降低；与MG相比，SPG三个脑区c-Fos MOD显著升高。蛋白质印迹显示，MG三个脑区c-Fos相对表达水平较BC显著降低；与MG相比，SPG前额叶皮质和杏仁核c-Fos水平显著升高，下丘脑呈一致上升趋势但差异无统计学意义。对OXTR，免疫组织化学显示MG三个脑区OXTR MOD较BC显著降低，SPG较MG显著升高；蛋白质印迹显示MG三个脑区OXTR相对表达水平较BC显著降低，SPG前额叶皮质和下丘脑OXTR水平显著升高，杏仁核呈上升趋势但无统计学意义。
3.4 捏脊干预在ASD模型大鼠中诱导多脑区协同效应。通过轮廓分析，研究人员评估三组大鼠前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中c-Fos和OXTR协调表达模式。平行性检验显示三组间c-Fos和OXTR在三个脑区的表达趋势无显著差异；水平检验显示三组间三个脑区c-Fos和OXTR总体平均水平存在显著差异；平坦性检验显示c-Fos和OXTR在三个脑区整体表达水平有显著差异，其中c-Fos在杏仁核表达最高，OXTR在前额叶皮质表达最高。结论为捏脊可能通过多脑区协调调控改善ASD共情能力。
讨论部分总结。讨论指出，MNS参与动作意图加工、情绪共鸣和社会认知，是共情重要神经基础；啮齿动物共情神经机制可能依赖与MNS协同的分布式脑网络。前额叶皮质、下丘脑和杏仁核被选为目标区域，因为它们是社会-情绪网络关键节点并与MNS功能交互：前额叶皮质负责认知整合，杏仁核参与情绪评价，下丘脑调节生理应激反应，三者协调形成共情反应。ASD患者前额叶皮质与杏仁核功能连接显著降低，社会认知任务中前额叶皮质激活异常，ASD模型大鼠这些脑区异常与社交缺陷密切相关。PN22至PN36是啮齿动物神经发育可塑性关键窗，突触修剪和环路精修活跃，前期研究显示捏脊在PN23、PN37和PN51有疗效，PN23和PN37改善优于PN51，提示早期发育阶段疗效更明显，因此选择该阶段干预。ASD个体常见共情缺陷，MNS异常；模仿能力缺陷与杏仁核和眶额皮质（OFC）神经元功能障碍相关。研究人员基于前期发现提出，捏脊可能通过调节社会-情绪脑区改善ASD样行为，而ASD核心症状不太可能源自单一脑区，MNS理论强调多区域协调必要性。c-Fos是即刻早期基因c-Fos编码的磷酸化蛋白，是神经元激活关键标志，可被多种应激快速诱导，反映脑区神经元激活状态，并作为功能示踪工具研究特定刺激激活的神经通路和时空特征。OXTR方面，催产素是下丘脑室旁核和视上核合成的神经肽，与社交行为密切相关，异常可导致共情缺陷、社交功能障碍和焦虑样行为；OXTR基因敲除或功能缺陷动物模型表现典型ASD样行为；催产素干预ASD模型大鼠可激活细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）信号通路改善社交缺陷；按摩等触觉刺激可增加ASD个体催产素水平并激活奖赏相关神经环路；推拿刺激皮肤CT纤维（CT fibers）可能触发催产素升高，产生愉悦感并缓解社交缺陷；前期工作也发现推拿干预显著增加ASD模型大鼠血清催产素表达。因此选择c-Fos和OXTR为指标。
结果解释：免疫组织化学和蛋白质印迹一致显示MG大鼠前额叶皮质、杏仁核和下丘脑c-Fos和OXTR表达下调，提示这些与情绪和社交认知密切相关的脑区神经元激活水平和催产素信号可能较低。大多数区域比较中，捏脊显著上调两种蛋白，未达显著的区域如下丘脑c-Fos和杏仁核OXTR也呈一致上升趋势。c-Fos通常在刺激后30至60 min达峰，而本研究在恐惧共情测试结束后5 min内取材，因此检测到的c-Fos主要反映实验程序包括恐惧共情任务诱导的神经元激活，而非真实基础神经元活动水平。MG大鼠前额叶皮质、下丘脑和杏仁核OXTR下调可能反映共情相关脑区催产素信号不足，可能是其社交奖赏缺陷和共情损害的重要分子基础。捏脊作为浅表机械刺激，节律轻柔提捏背皮，可能激活背皮中与愉悦触觉相关的躯体感觉神经纤维，并向上投射至多区域社会-情绪网络，从而正向调节这些脑区催产素信号系统，改善社交和共情缺陷。轮廓分析进一步显示：平行性检验无显著差异，表明捏脊对前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中这些分子的调控具有协同和方向一致性；水平检验显著，表明模型状态导致该协同网络整体抑制，捏脊具有全局上调和恢复作用；平坦性检验显示各蛋白在各脑区基础表达存在固有差异，c-Fos在杏仁核最突出，可能反映其作为情绪和应激反应关键枢纽的基础活动较高，OXTR在前额叶皮质最高，与其作为高级整合中心、社交行为、决策和情绪调节依赖催产素信号的功能角色一致。这些固有表达差异在组间保持，支持捏脊干预未改变不同分子在不同脑区的功能比例分布。提示捏脊治疗ASD相关社交和共情缺陷可能通过协调多区域调控而非孤立作用于单一脑区。蛋白质印迹中下丘脑c-Fos和杏仁核OXTR无统计学意义不否定总体结论，因为这些蛋白呈一致上升趋势，轮廓分析确认平行多区域调控，免疫组织化学在相同区域检测到显著增加也进一步佐证生物学效应；差异可能反映两种技术敏感性不同，蛋白质印迹测定异质组织匀浆总蛋白可能低估区域特异亚核局部变化，而免疫组织化学空间分辨率更高。局限性：仅检测c-Fos和OXTR，未来需体内多通道电生理验证脑区因果连接；恐惧共情测试可能受个体对社会线索敏感性差异影响，未来需更精细行为分析控制混杂；样本量不足以进行性别分层分析，需研究捏脊在ASD模型中的性别特异性效应。
研究结论翻译：捏脊疗法有效改善VPA诱导ASD大鼠模型的核心行为缺陷，包括社交功能障碍和共情能力受损。该治疗效应可能与同步调节前额叶皮质、下丘脑和杏仁核中关键蛋白表达，如c-Fos和OXTR，密切相关。本研究提供初步实验证据，支持捏脊疗法通过协同调控参与社交和共情行为的多个脑区间功能连接模式，从而改善ASD共情缺陷的假说。
