PPM1H缺失以LRRK2依赖方式改变突触内α-synuclein定位

《Molecular Brain》：PPM1H loss alters intrasynaptic alpha-synuclein localization in a LRRK2-dependent manner

　　

LRRK2（leucine-rich repeat kinase 2）基因突变是帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的主要遗传原因，并通过增加LRRK2激酶活性诱导RAB GTPases过度磷酸化。磷酸酶PPM1H（protein phosphatase 1H）通过选择性去磷酸化LRRK2磷酸化的RAB蛋白来抵消该活性。在此，研究人员使用原代PPM1H敲除（knockout）神经元研究PPM1H缺失及由此导致的RAB蛋白过度磷酸化如何影响α-突触核蛋白（alpha-synuclein，aSyn）——PD病理中的关键蛋白——在突触前终末的分布。研究人员发现PPM1H缺陷显著增加aSyn与突触前标志物Bassoon之间的距离，表明aSyn从突触前部移位。药理学LRRK2激酶抑制可挽救该表型，将突触内aSyn定位恢复至野生型（wild-type，WT）值。这些发现表明PPM1H缺失以LRRK2激酶活性依赖方式改变aSyn定位，提示LRRK2磷酸化RAB蛋白水平升高破坏突触前aSyn的纳米尺度组织。

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见神经退行性疾病，特征为进行性神经元丢失以及错误折叠的α-突触核蛋白（alpha-synuclein，aSyn）聚集成路易体（Lewy bodies）和神经突。aSyn的精确生理功能尚未完全明确，但其富集于突触前终末，并被认为参与调节神经递质释放。富亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）基因突变是家族性和散发性PD的主要遗传原因。致病突变增加LRRK2激酶活性，并诱导部分RAB GTPases（细胞内运输关键调节因子）过度磷酸化。蛋白磷酸酶1H（protein phosphatase 1H，PPM1H）通过选择性去磷酸化LRRK2靶向的RAB蛋白来抵消LRRK2活性。超活性LRRK2表达和PPM1H缺失均可加重暴露于aSyn预形成纤维（preformed fibrils，PFFs）神经元中的aSyn聚集，提示RAB过度磷酸化参与aSyn病理。Brzozowski et al. 曾证明，在野生型（wild-type，WT）神经元中药理学抑制LRRK2激酶改变aSyn在突触前终末内的定位。然而，该效应是否由LRRK2磷酸化RAB蛋白水平降低介导，以及LRRK2高活性或PPM1H缺失时磷酸化RAB水平升高如何影响突触处aSyn定位，仍不清楚。因此，研究人员研究PPM1H缺失导致磷酸化RAB水平升高如何影响突触前aSyn丰度和定位。研究人员使用同窝PPM1H^+/+、PPM1H^+/-、PPM1H^-/-小鼠胚胎来源的原代皮层神经元，发现PPM1H缺失不显著改变aSyn阳性突触比例，但显著增加aSyn与突触前标志物Bassoon荧光强度峰之间的距离，表明aSyn从突触前部移位。LRRK2激酶抑制剂MLi-2可挽救该表型，使突触内aSyn定位恢复至WT值。研究结论表明，PPM1H缺失以LRRK2激酶活性依赖方式改变aSyn定位，提示LRRK2磷酸化RAB蛋白水平升高破坏突触前aSyn的纳米尺度组织。该研究将RAB磷酸化状态与突触内aSyn空间组织联系起来，为理解LRRK2相关PD中aSyn病理和突触功能障碍提供了机制线索。

关键技术方法概括：研究人员采用同窝PPM1H^+/+、PPM1H^+/-、PPM1H^-/-小鼠胚胎来源的原代皮层神经元，在体外第21天（day in vitro 21，DIV21）固定，免疫染色aSyn、突触前标志物Bassoon、突触后标志物Homer1和胞体树突标志物MAP2，并以突触前后标志物并置识别突触。使用高分辨率Airyscan显微镜测量荧光强度峰间距离。通过免疫印迹（Western blot）定量pT⁷³ RAB10与总RAB10。用LRRK2激酶抑制剂MLi-2（300 nM）处理，并以混合效应模型（mixed effects model）、单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey多重比较检验分析。

研究结果：
PPM1H缺陷改变α-突触核蛋白的突触内定位
研究人员将同窝PPM1H^+/+、PPM1H^+/-、PPM1H^-/-小鼠胚胎来源的原代皮层神经元在DIV21固定，并对aSyn、Bassoon、Homer1和MAP2进行免疫染色。突触根据突触前和突触后标志物的并置识别。定量显示，各基因型间aSyn阳性突触比例无显著差异，提示PPM1H缺失不引起突触前aSyn定位的明显改变；既往工作显示PPM1H缺失不改变原代神经元培养中的突触总数。随后，研究人员使用高分辨率Airyscan显微镜测量PPM1H^+/+和PPM1H^-/-神经元中Bassoon、Homer1和aSyn荧光强度峰之间的距离。Bassoon与Homer1距离在基因型间未改变，表明PPM1H缺失不改变突触间隙宽度。相反，PPM1H^-/-神经元中Bassoon与aSyn距离显著大于PPM1H^+/+对照（0.122 μm vs. 0.084 μm），提示PPM1H缺失使aSyn定位远离突触前部。为评估该效应是否依赖LRRK2激酶活性，研究人员用LRRK2激酶抑制剂MLi-2处理PPM1H^-/-神经元。与既往工作一致，MLi-2显著降低PPM1H^-/-神经元中pT⁷³ RAB磷酸化。MLi-2处理不改变Bassoon与Homer1距离，但显著降低Bassoon与aSyn荧光强度峰距离。在DMSO处理的PPM1H^-/-神经元中，突触前标志物与aSyn距离平均为0.118 μm；MLi-2处理使该距离恢复至0.084 μm，与未处理PPM1H^+/+神经元的平均值一致。这些结果表明，PPM1H缺陷神经元中aSyn定位改变依赖LRRK2激酶活性，并提示该效应由LRRK2磷酸化RAB蛋白水平升高所介导。

讨论部分总结：研究人员指出，磷酸化RAB影响突触前终末aSyn定位的下游机制尚待阐明。一种可能性是aSyn定位改变反映自噬（autophagy）导致的局部周转受损，因为突触前终末是自噬体形成的主要位点，且既往研究显示LRRK2介导的RAB过度磷酸化破坏轴突自噬。另一种可能是，aSyn定位改变与LRRK2依赖性RAB3磷酸化引起的突触囊泡前体（synaptic vesicle precursors，SVPs）运输缺陷有关。它也可能与最近报道的突触前释放位点去组织化有关，后者被认为源于磷酸化RAB3与活性区效应器RIM1和RIM2之间相互作用受损。由于aSyn被认为调节突触前终末的神经递质释放，此处描述的定位改变可能促成既往报道的致病性LRRK2对突触传递的影响。然而，aSyn与Bassoon空间关系变化的确切功能后果仍有待确定。总之，研究结果表明PPM1H缺失改变内源性aSyn在突触前终末的定位，增加其与突触前标志物Bassoon的距离。LRRK2激酶抑制剂MLi-2处理挽救了该效应，强烈表明该定位改变由LRRK2磷酸化RAB蛋白水平升高所介导。结合既往工作，这些发现支持一个模型：突触内aSyn定位对RAB磷酸化状态敏感，RAB磷酸化降低使到突触前终末的距离减小，而RAB磷酸化升高使其增加。