细胞培养基影响呼吸道合胞病毒G蛋白糖基化修饰及单克隆抗体识别的研究

《Virology Journal》：Cell culture medium influences RSV G protein glycosylation and recognition by monoclonal antibodies

呼吸道合胞病毒（RSV）G糖蛋白在转化细胞系或原代细胞中培养后呈现高度糖基化及大小异质性。然而，细胞培养基是否能够影响糖基化模式尚属未知。为此，研究人员检测了培养基选择是否可影响RSV G蛋白的糖基化、病毒感染性及抗体识别。在三种不同培养基中培养的HEK293T细胞中表达了RSV G胞外域，观察到显著的分子量差异，而该差异在糖基化缺陷型敲除细胞中被消除。在相同培养基中培养的A549细胞中产生的RSV，其病毒储备液中G蛋白相对信号及病毒扩散亦存在差异。较高的表观G蛋白糖基化与人类F蛋白特异性单克隆抗体对RSV感染细胞结合信号的降低相关。上述数据表明，细胞培养基可影响RSV制备物的生物学特性，并对抗体识别及病毒扩散产生相应影响。

细胞培养基影响RSV G蛋白糖基化与单克隆抗体识别的研究解读

一、研究背景与问题

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是婴幼儿、儿童及老年人严重下呼吸道感染的主要病原体之一。在其表面蛋白中，黏附糖蛋白G经历广泛的翻译后修饰，包含4至5个N-连接糖基化位点及约30至40个O-连接糖基化位点，使其表观分子量较氨基酸序列预测值成倍增加。这些糖基化修饰可能参与抗原遮蔽并影响蛋白功能特性。已有研究表明，在原代人支气管上皮培养体系（包括气-液界面系统）中产生的G蛋白表观分子量约为170 kDa，较标准转化细胞系如HEp-2或A549中产生的约55至90 kDa的G蛋白具有更显著的糖基化程度。此外，不同连续细胞系在同一完全培养基中培养时，G蛋白在电泳迁移率及与G特异性单克隆抗体反应性方面均存在差异。然而，既往研究在比较不同细胞系时培养基保持恒定，或在比较原代与连续培养时细胞身份与培养基同时变化，因此无法区分细胞身份与培养基成分对糖基化差异的各自贡献。培养基组成可影响核苷酸糖供体的可用性及糖基化通路活性，培养基依赖性代谢效应可能是糖基化异质性的合理驱动因素。此外，该问题对于RSV被特异性抗体制剂识别的过程同样具有相关性。已获批的治疗性单克隆抗体包括帕利珠单抗（palivizumab）、尼塞韦单抗（nirsevimab）及克莱索维单抗（clesrovimab）均靶向F蛋白，但病毒颗粒组成及糖蛋白组织可能影响抗体结合与中和活性。基于上述背景，研究人员开展了本研究，旨在验证培养基选择是否影响RSV G蛋白糖基化，以及该影响是否与病毒感染性及F蛋白特异性单克隆抗体结合相关。

二、研究内容与结论

研究人员首先利用重组蛋白表达系统检测培养基选择对RSV G蛋白糖基化的影响。可溶性G蛋白（sG）在维持于培养基A、B或C中的HEK293T细胞中表达并纯化，通过SDS-PAGE及Western blot分析发现，sG的表观分子量随培养基不同而显著差异：培养基A中表达蛋白分子量最低（约60至90 kDa），培养基B中为中等大小（约100 kDa），培养基C中分子量最大（约100至130 kDa）。为确认这些分子量差异由糖基化引起，研究人员在HEK293T GALE/GALK1敲除细胞（半乳糖代谢缺陷型）中表达sG，结果发现培养基依赖性大小差异消失，sG检测为较低分子量簇（约15至25 kDa），与未完全加工的非半乳糖基化聚糖残留异质性一致。在RSV感染背景下，A549细胞在三种培养基中感染RSV A-0594-EGFP后24小时，全细胞裂解物中G蛋白的Western blot分析同样观察到与重组表达一致的培养基依赖性分子量层级差异，尽管绝对差异较小。随后研究人员评估了培养基选择对RSV制备物感染性的影响。A549细胞以MOI 1在培养基A、B或C中感染RSV A-0594-EGFP，以Opti-MEM（培养基B）作为参考条件。病毒扩散动力学通过整合GFP荧光强度在120小时内定量，结果显示培养基C中培养的病毒扩散显著高于培养基A和B。为进一步确定观察到的扩散差异是否依赖于生产培养基的持续存在，研究人员以在三种培养基中生产的病毒储备液按MOI 1感染A549细胞，吸附后去除接种物并在所有条件下更换为Opti-MEM（培养基B）。结果显示病毒扩散差异持续存在：培养基C中生产的病毒扩散最高，培养基B中生产的病毒呈中间表型，培养基A中生产的病毒显著减弱。这表明观察到的差异不依赖于吸附后生产培养基的持续存在，而与病毒储备液制备物的固有特性相关，包括表观G蛋白糖基化差异。研究人员进一步检测了sG糖基化差异是否与病毒储备液中相对G蛋白信号相关。将三种培养基生产的病毒储备液按Bradford法调整至相等总蛋白浓度后裂解并进行Western blot分析，G蛋白条带强度归一化至相应N蛋白信号计算相对G/N比值。结果显示培养基A或B中生产的病毒G/N比值低于培养基C中生产的病毒。相比之下，F/N比值在三种培养基生产的病毒之间无显著差异。研究人员随后评估了前融合（pre-F）特异性抗体克莱索维单抗和尼塞韦单抗，以及前融合和后融合（post-F）均反应的抗体帕利珠单抗（均以红色荧光染料标记）对感染细胞的结合。以RSV A-0594-EGFP报告病毒的GFP强度归一化荧光信号。结果显示，在培养基B和C中培养的RSV感染细胞中，帕利珠单抗、克莱索维单抗和尼塞韦单抗的结合信号显著低于培养基A中培养的细胞。帕利珠单抗和克莱索维单抗在培养基B和C中结合均降低，尼塞韦单抗结合在培养基B中显著降低。相比之下，代表后融合抗体结合的蓝色信号在三种培养基中基本保持不变。研究人员还测定了三种F蛋白特异性抗体的中和活性，使用培养基B和C制备的病毒储备液计算半数抑制浓度（IC₅₀）。培养基A中生产的病毒因其在IncuCyte读数中的减弱扩散动力学低于可靠解析剂量-反应曲线所需的动态范围而被排除。帕利珠单抗持续呈现最高IC₅₀值（约1.5 μg/ml），而尼塞韦单抗和克莱索维单抗表现出更强效力。培养基B和C生产的病毒之间IC₅₀值无统计学显著差异。通过比较病毒储备液的RT-qPCR Cq值与感染滴度（TCID₅₀/ml），发现培养基A中生产的病毒Cq值高于培养基C中生产的病毒，而其感染滴度约低100倍，表明感染滴度差异大于相应RT-qPCR相对信号差异，与各病毒储备液制备物中感染性物质与RT-qPCR可检测病毒物质比率的差异一致。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：重组蛋白表达与纯化系统（在HEK293T细胞及糖基化缺陷型HEK293T GALE/GALK1敲除细胞中表达可溶性G蛋白，经固定化金属亲和层析纯化）；Western blot与密度测定分析（用于评估G、F、N蛋白分子量及相对信号）；病毒感染性测定（基于IncuCyte系统的GFP整合荧光强度实时定量病毒扩散动力学）；TCID₅₀感染滴度测定（在HEp-2细胞上进行）；RT-qPCR（针对NS1/NS2连接区域）；抗体标记与结合测定（治疗性抗体经DyLight荧光染料标记后检测感染细胞结合信号）；中和试验（四参数逻辑非线性回归计算IC₅₀值）。研究使用了三种商业培养基：培养基A（EX-CELL 293无血清培养基，Sigma-Aldrich）、培养基B（Opti-MEM I减血清培养基，Gibco）和培养基C（VaccineXpress，Cytiva），其中Opti-MEM作为标准参考培养基。病毒株为RSV A-0594-EGFP（ON1基因型）。

四、研究结果

培养基依赖性效应影响RSV G蛋白大小、病毒储备液中相对蛋白信号及病毒扩散。重组sG蛋白在HEK293T细胞中随培养基不同呈现不同表观分子量，该差异在GALE/GALK1敲除细胞中消失，证实为糖基化所致。RSV感染A549细胞后同样观察到培养基依赖性G蛋白分子量差异。病毒扩散在培养基C中显著高于培养基A和B，且当病毒储备液感染后更换为标准培养基时差异仍持续存在。培养基A或B生产的病毒G/N比值低于培养基C，而F/N比值无显著差异。

抗体结合与中和活性。在培养基B和C中培养的感染细胞中，帕利珠单抗、克莱索维单抗和尼塞韦单抗的结合信号显著低于培养基A中培养的细胞，而后融合对照抗体结合基本不变。培养基B和C生产的病毒之间IC₅₀值无显著差异，帕利珠单抗IC₅₀最高，尼塞韦单抗和克莱索维单抗效力更强。

病毒储备液RT-qPCR信号与感染滴度比较。培养基A中生产的病毒Cq值较高而感染滴度约低100倍，表明感染性物质与RT-qPCR可检测物质比率存在差异。

五、讨论与结论

本研究综合表明，细胞培养基的选择影响RSV制备物的特性，包括G蛋白糖基化程度、病毒储备液中相对G蛋白信号、病毒感染性及F蛋白特异性抗体结合。由于在相同细胞背景下G蛋白分子量随培养基不同而差异，且该差异在GALE/GALK1敲除细胞中被消除，培养基组成而非细胞类型特异性糖基化机制差异决定了糖基化程度。这提示营养物质和代谢物可用性可能对先前描述的细胞系与原代气道培养之间G蛋白糖基化差异有所贡献。培养基组成因此是不同蛋白表达系统间比较糖基化模式时的关键变量。值得注意的是，表观分子量最高即糖基化程度最广泛的G蛋白与相应培养基C生产的病毒储备液中最高相对G/N比值相关，提示G蛋白翻译后成熟可能对病毒储备液中相对G蛋白信号有贡献。病毒扩散差异在吸附后更换为标准培养基后仍持续存在，表明该表型不依赖于生产培养基的持续存在，而与储备液固有特性相关。培养基选择还影响前融合特异性抗体对感染细胞的结合，培养基B和C中结合信号低于培养基A，但IC₅₀值无显著差异，表明感染细胞抗体结合信号差异未伴随中和活性的统计学显著差异。研究局限性包括：培养基确切成分为专有信息，无法识别导致差异的具体组分；培养基B为减血清而非无血清配方，其差异可能反映血清含量及较低营养可用性；研究使用转化细胞系，原代气道上皮、气-液界面或气道类器官培养体系中是否出现类似幅度的培养基依赖性差异尚待确定。结论认为，本研究将细胞培养基的选择确定为制备和表征RSV储备液时应考虑的重要实验变量，这对于研究RSV生物学和免疫学特性的实验体系及三维细胞培养模型的应用具有实际意义。