《The Cerebellum》：Viral Tracing Gone Viral: Expanded Possibilities Call for Increased Caution in Describing Cerebellar Network Connections
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本综述讨论了巧妙构建的嗜神经病毒及病毒转基因在神经解剖学研究中的巨大扩展应用，尤其聚焦于小脑领域。得益于这些新型示踪技术近乎无限的可能性，关于脑内连接与功能的重要新信息正迅速涌现。然而，示踪技术总体上，特别是病毒示踪技术，可能隐藏着一些需要仔细评估的陷阱与缺陷
本综述讨论了巧妙构建的嗜神经病毒及病毒转基因在神经解剖学研究中的巨大扩展应用，尤其聚焦于小脑领域。得益于这些新型示踪技术近乎无限的可能性，关于脑内连接与功能的重要新信息正迅速涌现。然而，示踪技术总体上，特别是病毒示踪技术，可能隐藏着一些需要仔细评估的陷阱与缺陷，才能对所得结果做出正确解释。在提供一般性介绍后，本综述将简要讨论一些最常用的病毒示踪剂，重点关注其各自特性，并指出一些潜在且出乎意料的局限性。最后，研究人员讨论了近期关于一些新发现的小脑连接的观察结果，这些结果大多通过病毒示踪获得，应谨慎对待并需要仔细的重复验证。研究人员得出结论，只有在对示踪结果进行恰当评估之后，才有可能正确构建复杂的解剖网络并进而理解其功能。
论文主体内容总结
引言
为了完全理解人脑的功能，需要深入了解其组成部分——神经元——如何相互通信。神经解剖学专门处理神经系统内连接的描述，是现代神经科学研究中最古老的学科之一。尽管如今对人体解剖的描述已很详尽，但人类神经系统的解剖仍面临许多未知。现有的神经解剖学教科书信息多基于上世纪利用不完美技术进行的动物研究，这些技术包括显微解剖、消融、变性以及向特定脑区注射可运输物质进行的大量顺行或逆行示踪。虽然这些结果为理解大脑解剖提供了骨架，但仍需更详细的描述。新世纪涌现的新型示踪技术提供了大量额外的新数据，这些技术基于能在感染神经元内复制、甚至能在相连神经元间传递的嗜神经病毒。由于具备复制、跨神经元转移和基因工程潜力，它们展现出更高的灵敏度和选择性，尤其是在基因修饰小鼠中使用时，真正革新了神经解剖学知识。然而，这些技术也潜藏危险，本文将概述常用病毒示踪剂并指出研究者应注意的潜在陷阱，并据此讨论近期关于小脑输出组织的一些新发现。
病毒示踪剂的类型
理想的用于神经解剖学研究的嗜神经病毒需易于实验室管理和操作，并能引入中枢神经系统的局限区域。病毒或其有效载荷需要能够被可视化。目前，大多数用于示踪的病毒是几种改良的腺相关病毒（AAV）株和狂犬病病毒（RABV）株，此外伪狂犬病病毒（PRV）和单纯疱疹病毒（HSV）也被用作神经解剖示踪剂。多数病毒示踪研究在野生型或转基因小鼠品系中进行。
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比较病毒示踪剂与经典示踪剂
评估示踪剂质量的关键在于了解其摄取和转运机制，但许多情况下神经元感染的实际过程尚不清楚。重要的是，病毒示踪技术必须定性为顺行、逆行或双向示踪，并确定其是否及在多大程度上能以顺行或逆行方式跨神经元感染其他细胞。将病毒示踪剂与经典的辣根过氧化物酶耦联麦胚凝集素（WGA-HRP）、霍乱毒素B亚单位（CTb）、菜豆白细胞凝集素（PHA-L）和生物素化葡聚糖胺（BDA）等进行比较是评估其特性的好方法。但只有少数研究在相似实验范式下比较了这些经典示踪剂与病毒载体的标记特性，结论通常是病毒示踪与经典技术一样好或更好，但也注意到差异，表明病毒示踪结果需谨慎评估。
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病毒感染细胞类型
评估病毒颗粒如何进入宿主细胞以及不同细胞类型的感染率是否存在差异很重要。有些病毒只感染神经元，而另一些也可能感染胶质细胞。例如，PRV的Bartha株可进入星形胶质细胞但似乎不能在其中复制，从而阻止了非突触传播。PRV对感觉和自主神经系统的转染敏感性远高于运动系统，这使其在研究器官和平滑肌的神经支配中被广泛使用，但也意味着血管的自律神经支配可能会干扰对注射结构的神经支配结论。此外，PRV不感染灵长类神经元，因此不能用于研究灵长类神经系统。不同的PRV毒株在传播速度和方向上也有不同特征。类似的限制也见于HSV的不同毒株，它们在感染效率、运输方向、跨神经元感染难易程度以及通过感染胶质细胞扩散方面存在巨大差异，且感染通常导致细胞快速退化。
RABV的逆行跨神经元运输被认为优于α-疱疹病毒。RABV的重要特征是其能被所有细胞类型（外周感觉和自主神经元除外）无差别摄取，并在中枢神经系统内随时间敏感地逆行传播。感染后神经元可存活数周，病毒不会泄漏到周围结构。然而，RABV的一个明显缺点是严格的处理要求。未修饰的RABV已被用于描述从肌肉或特定脑区注射开始的逆行连接网络。在中枢神经系统中，病毒通过进入终末按钮感染，但在注射部位对胞体和树突的感染通常很差，这使得难以确定轴突末梢摄取的有效部位。此外，不同RABV毒株或在同一种毒株在不同物种中使用时可能产生不同结果。例如，在猴子中，小脑颗粒细胞可在皮层注射后作为第四级标记被CVS-11株RABV感染，但在大鼠中，当浦肯野细胞被感染后，却未观察到颗粒细胞或分子层中间神经元被感染，这表明物种差异可能影响该毒株从特定细胞类型转染连接神经元的倾向。对感染的敏感性在不同细胞类型间也存在差异，如小脑核团神经元易被感染，但与它们有连接的下橄榄核神经元却很少被感染，表明该毒株从感染神经元进入其突触前末梢的通路受阻。在其他实例中，病毒进入突触前神经元受到细胞外基质的特异性阻碍，例如在小脑核团中投射至下橄榄核的GABA能神经元抵抗RABV感染，这可能是因为其终末位于被胶质鞘包裹的特殊突触结构中。除了CVS-11毒株，还有其他“固定”的RABV毒株，它们可能表现出不同的转染特性，这种差异在基因工程改造病毒时可能会被放大。
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腺相关病毒（AAV）
不同血清型的重组AAV具有广泛不同的示踪特性。AAV可以感染但不能在神经元内复制，主要用于递送编码荧光蛋白的转基因。不同AAV血清型感染特定细胞类型的倾向不同，这种差异被认为取决于病毒表面衣壳蛋白的修饰。例如，用于建立小鼠连接组图谱的AAV1-EGFP并不显示任何突触后神经元，而另一种表达Cre的AAV1毒株却能成功实现突触后表达。注射的AAV1容易感染局部胞体，随后细胞开始大量产生荧光蛋白，利用顺行运输机制标记轴突和终末分支，因此可以清晰界定注射部位。然而，考虑到较长的存活时间，感染性AAV颗粒可能在脑内细胞外空间扩散多远并感染附近区域的神经元值得关注。其他血清型如AAV2、5、8和9据报道感染神经元的可能性较低，或显示出对特定细胞类型的偏好性。重要的是，尽管不同毒株作为顺行示踪剂的神经趋向性效力不同，但所有版本都显示出一定程度的逆行标记倾向。高度改进的逆行示踪AAV2-retro毒株已被报道，但其与RABV-G和荧光乳胶珠的比较研究显示，每种逆行示踪剂仍有其自身的偏好和特征。对于只能通过轴突末梢感染神经元的病毒示踪剂，其有效注射部位极难确定，通常需要共注射其他示踪剂来可视化，但不同物质可能具有不同的扩散特性。
病毒示踪剂标记的灵敏度与选择性
病毒标记的主要优势在于其自我复制能力或报告基因的无限制表达，使得整个感染神经元的精细分支都能轻松可视化，比经典示踪剂更突出。此外，利用Cre依赖的报告基因和转基因小鼠，现在可以对特定类型的神经元群体进行示踪。这种增强的灵敏度促成了对更多复杂连接的描述，例如最近发现小鼠小脑核团中的某些神经元轴突可下行至腰骶脊髓，以及一些被认为只投射到下橄榄核的GABA能神经元实际上拥有终止于其他脑干区域的侧支。然而，病毒示踪的使用虽增强了灵敏度和选择性，也可能带来需要恰当评估的危险，理想情况下，意外发现应由其他技术和研究者重复验证，并在其他动物模型中确认。
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从小脑核团到腹侧被盖区（VTA）和黑质致密部（SNc）是否存在主要的直接投射？
近期关于小脑核团投射至VTA和SNc的研究备受关注。尽管不怀疑小脑对行为动机方面的影响，但对其是否有直接通路存有保留意见。采用变性或经典顺行示踪剂的研究并未令人信服地证明啮齿类动物中存在从CN到VTA的强健投射。虽然病毒示踪的超高灵敏度可能检测到先前技术遗漏的稀疏纤维，但仅少量纤维的存在也对该连接的重要性提出质疑。作者指出，使用荧光示踪剂并配合自动跟踪和数字化图谱匹配的研究可能存在风险，如纤维经过区域与终末分支的区分问题，以及实际样本与图谱的轻微错位可能导致所谓的投射区域列表过长。在Carta等人的研究中，使用了300纳升（nl）的HSV129-GFP注射到小鼠小脑核团。这个体积相当于直径超过800微米的球体，而臂旁核位于注射位点前方约300微米处，臂旁核对VTA有丰富的投射，因此需排除其参与。此外，该研究后续实验中使用了更大体积的病毒转基因，且显示的通道视紫红质标记密度远高于早期研究或艾伦研究所公开数据所示。艾伦研究所的一项使用AAV1注射的研究也未将VTA列为最高神经支配密度的40个区域之一。这些迹象表明VTA很难被称为CN传出纤维的显著或“强健”的终止区域。该研究的电生理和行为实验使用光遗传刺激，但CN也投射到VTA附近的区域，如导水管周围灰质、上丘、外侧下丘脑区和未定带，这些区域也发出纤维至VTA，因此需要考虑激光刺激对这些区域的可能影响。
