基于IBMP嵌合抗原的重优化双抗原夹心ELISA（DAgS-ELISA）检测人血清抗T. cruzi抗体的II期诊断性能评价

《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases》：Double-antigen sandwich ELISA based on chimeric antigens for detection of antibodies to Trypanosoma cruzi in human sera – A phase II study

目的：慢性恰加斯病（Chagas disease, CD）的实验室确诊依赖血清学，但传统间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）依赖物种和类别特异性二抗，且仍易出现交叉反应。嵌合抗原IBMP-8.1、IBMP-8.2、IBMP-8.3和IBMP-8.4在间接形式中表现良好，一项概念验证性I期双抗原夹心ELISA（double-antigen sandwich ELISA, DAgS-ELISA）获得高特异性但敏感性有限。研究人员在II期研究中重新优化并验证了IBMP-DAgS-ELISA。方法：将四种抗原偶联至辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP），并通过棋盘滴定重新优化。使用来自巴伊亚州中央公共卫生实验室的403份T. cruzi阳性血清和399份T. cruzi阴性血清，以潜在类别分析（latent class analysis, LCA）参考标准评估诊断性能，应用单一预设反应指数（reactivity index, RI）临界值（RI ≥ 1.0）。在206份来自其他感染性疾病个体的血清中评估交叉反应性，并在28份阳性血清和28份阴性血清中三复孔检测板内重复性。结果：IBMP-8.4在多数性能指标中最高（曲线下面积（area under the curve, AUC）99.8%、敏感性99.8%、特异性98.0%、准确性98.9%、诊断优势比（diagnostic odds ratio, DOR）19,648、Cohen’s κ 0.98），IBMP-8.3特异性最高（99.0%）。平行组合IBMP-8.3/IBMP-8.4达到100%敏感性和97.0%特异性。总体交叉反应性低，IBMP-8.4无交叉反应（0/206），包括针对Leishmania和Schistosoma spp.。在三复孔检测中，所有抗原的敏感性（92.9–100%）和AUC（94.3–100%）稳定，而重复性子集中特异性变化较大（78.6–100%）。结论：重优化的IBMP-DAgS-ELISA与相同抗原的间接ELISA基准相当，同时检测总抗体，不依赖免疫球蛋白类别或宿主物种。IBMP-8.4单独或与IBMP-8.3联合，是慢性CD血清学的准确选择，并在完全定义的嵌合抗原基础上重建了双抗原夹心平台。

恰加斯病（Chagas disease, CD）由血流鞭毛原虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起，是美洲最具影响的被忽视热带病之一。全球约7.5–8.0百万人感染，负担集中于拉丁美洲；由于人类迁移，感染已在44个国家报告，先天传播成为全球新发感染的主要途径，并被列入世界卫生组织2021–2030年被忽视热带病路线图的消除公共卫生问题目标。慢性CD还给卫生系统和患者带来显著经济负担。疾病分为急性期和慢性期，诊断挑战不同。急性期高寄生虫血症可通过新鲜血显微镜、Strout浓集法或血培养等检测；靶向卫星或动基体DNA的常规和实时PCR已越来越多地用于急性期、先天性和再激活诊断，但尚未在国际指南中普遍标准化。慢性期寄生虫血症低且常间歇，抗T. cruzi IgG抗体检测成为实验室诊断基石。国际指南建议使用至少两种基于不同抗原原理的血清学试验，反映缺乏确切金标准以及试验性能存在内在变异。ELISA因可扩展、成本效益和实验室自动化兼容性而最常用，但传统间接ELISA存在交叉反应，尤其与Leishmania spp.，并依赖物种特异性二抗。重组抗原提高特异性，但T. cruzi广泛遗传多样性可能影响表位一致识别，从而影响敏感性。嵌合重组抗原结合保守和免疫优势表位，以缓解这些限制并保持高特异性、高敏感性。在此框架下，研究人员设计了四种嵌合抗原IBMP-8.1、IBMP-8.2、IBMP-8.3和IBMP-8.4，既往在间接ELISA、液相微阵列、Western blot、免疫层析快速检测和生物传感器等平台中持续显示高诊断准确性（ROC曲线下面积常超过99%）和低交叉反应，并在人血清和犬血清中有效。尽管如此，这些应用依赖使用物种特异性二抗的间接免疫分析，限制其多物种监测用途，并主要检测IgG类抗体。双抗原夹心ELISA（DAgS-ELISA）通过使用酶标抗原替代二抗，可检测总抗体，不依赖免疫球蛋白类别或宿主物种，扩展了跨宿主和感染阶段的应用潜力。I期概念验证研究表明，基于IBMP的DAgS-ELISA可可靠区分T. cruzi阳性与阴性人血清，获得高特异性和总体诊断准确性，但敏感性不理想，四种抗原为74.4%至88.4%，低于相同抗原间接ELISA，作者将其明确列为平台进入诊断应用前需优先解决的问题。因此，研究人员认为重新优化抗原–酶偶联物和试验配置可提高敏感性至与间接ELISA相当，同时保持已证明的高特异性。本II期研究使用新制备的抗原–酶偶联物和大型、表征良好的血清样本panel，全面评估IBMP-DAgS-ELISA诊断性能，并采用试验重新优化、基于LCA的样本重分类和扩展性能指标，进一步表征慢性CD背景下的重复性、分析一致性和诊断性能。研究结论表明，重优化的IBMP-DAgS-ELISA与相同抗原的间接ELISA基准相当，同时检测总抗体且不依赖免疫球蛋白类别或宿主物种；IBMP-8.4单独或与IBMP-8.3联合是慢性CD血清学的准确选择，并在完全定义的嵌合抗原基础上重建了双抗原夹心平台。其意义在于为慢性CD血清学提供不依赖二抗、可跨物种检测总抗体的候选平台，并支持在共流行地区和筛查场景中的进一步应用。

为开展研究，研究人员生产了嵌合重组抗原IBMP-8.1、IBMP-8.2、IBMP-8.3和IBMP-8.4，并将抗原通过高碘酸盐活化法与辣根过氧化物酶（HRP）偶联；用棋盘滴定重新优化抗原包被量、HRP标记抗原稀释度和血清稀释度。诊断性能评估使用巴伊亚州中央公共卫生实验室（LACEN/BA）来源的403份T. cruzi阳性血清和399份T. cruzi阴性血清，样本来自154个市，主要位于巴伊亚州；样本此前经两种不同抗原原理的血清学试验表征，不一致者再用间接免疫荧光分析，最终由潜在类别分析（LCA）确定血清学状态。交叉反应用206份其他感染或寄生虫病血清；板内重复性用28份阳性和28份阴性血清三复孔。统计分析包括ROC曲线、反应指数（RI）、Cohen’s κ和变异系数（CV）。

结果部分：血清学样本panel特征方面，研究人员从LACEN获得423份T. cruzi阳性和400份T. cruzi阴性血清，先用IBMP间接ELISA重新评估以确认反应性，再以LCA定义最终血清学状态；423份初始阳性中20份被重分类为阴性，1份阴性被重分类为阳性，21份不一致血清被排除，最终分析panel为403份阳性和399份阴性。样本来自154个市，有来源记录的822份中804份（97.8%）来自巴伊亚州；阳性参与者中255名女性（60.4%）、167名男性（39.6%），平均年龄62.0±12.4岁，中位64岁，四分位距53–70岁，范围22–92岁，84.8%为50岁及以上，符合长期暴露、老龄化的慢性恰加斯病流行病学特征。IBMP-DAgS-ELISA优化方面，优化目标为信噪比，即T. cruzi阴性样本平均光密度（OD）<0.150、阳性血清>1.000；最佳条件为IBMP-8.1、IBMP-8.2和IBMP-8.4每孔12.5 ng，IBMP-8.3每孔25 ng；HRP标记抗原稀释度IBMP-8.1和IBMP-8.2为1:16,000，IBMP-8.3和IBMP-8.4为1:32,000；最佳血清稀释度为IBMP-8.1未稀释，IBMP-8.2和IBMP-8.3为1:8，IBMP-8.4为1:2。II期诊断性能方面，在优化条件下检测全panel，并统一采用单一预设RI≥1.0临界值；所有抗原在阳性和阴性组间差异高度显著（p<0.0001）。IBMP-8.4获得最高AUC、准确性、诊断优势比（DOR=19,648）和Cohen’s κ；IBMP-8.1与IBMP-8.3敏感性相似，IBMP-8.3与IBMP-8.4特异性重叠；总体上IBMP-8.3特异性最高、阳性似然比最高，IBMP-8.4敏感性最高。联合检测时，串联检测特异性为98.7–100%，但敏感性降至74.7–91.6%；平行检测使敏感性最大化至95.3–100%，最佳平行组合IBMP-8.3/IBMP-8.4达到100%敏感性和97.0%特异性。交叉反应分析方面，检测206份其他感染性疾病血清，交叉反应率IBMP-8.1为1.46%（3/206），IBMP-8.2为0.97%（2/206），IBMP-8.3为3.88%（8/206），IBMP-8.4为0/206；IBMP-8.3交叉反应最高，且灰区结果比例最高（16.5%，34/206）。反应模式在各抗原间不一致重叠，提示抗原特异性交叉结合而非共享干扰；IBMP-8.4对Leishmania spp.和Schistosoma spp.也无反应，在共流行地区具有优势。板内重复性方面，用28份阳性和28份阴性血清三复孔检测，各抗原敏感性为92.9–100%，AUC为94.3–100%，保持稳定；特异性为78.6–100%，变化较大。IBMP-8.4第一复孔特异性最低，28份阴性中22份正确分类；IBMP-8.2第二复孔准确性最低（87.5%），特异性82.1%。阳性血清变异系数最高为IBMP-8.1（0.68–0.69），最低为IBMP-8.2（0.37–0.38）。

讨论部分总结：慢性CD缺乏确切金标准，长期推动改进血清学检测。研究人员此前已在间接ELISA、Western blot和快速诊断检测中评估IBMP嵌合重组抗原，持续显示高诊断性能，但这些方法依赖IgG检测和物种特异性二抗，限制其用于急性期诊断和非人储存宿主。DAgS-ELISA通过使用HRP标记抗原而非二抗，可检测独立于抗体类别或宿主物种的总抗体，扩大多物种和多阶段诊断潜力；其机制上捕获臂和检测臂均存在抗原有利益于高亲和力抗体结合，并在无高亲和力抗体时产生极低背景，从而无需样本预稀释并可捕获IgG、IgM和IgA。这种类别非依赖性行为尤其适用于IgM占优的急性期和先天感染，以及家养和森林储存宿主血清监测，符合世界卫生组织倡导的One Health策略。双抗原夹心形式已在乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、狂犬病、甲型流感、SARS-CoV、SARS-CoV-2、基孔肯雅、水痘-带状疱疹、衣原体、梅毒以及猪圆环病毒、非洲猪瘟病毒和牛无形体病等兽医病原血清学中应用，通常准确性高于90%、背景低并兼容未稀释血清。在恰加斯病中，该配置此前体现于EIE-Recombinante-Chagas，使用CRA和FRA抗原同时作为捕获和过氧化物酶标记检测分子；尽管其敏感性和特异性高，但生产已停止，巴西目前没有可用的恰加斯病双抗原夹心试验。本研究优化的IBMP-DAgS-ELISA在完全定义的嵌合抗原基础上重建了该能力。I期概念验证确认IBMP-DAgS-ELISA可区分T. cruzi阳性和阴性血清，但敏感性和特异性略低于间接ELISA；本II期研究通过试验重新优化、新制备偶联物和扩大且表征良好的panel提高检测性能。IBMP-8.4敏感性从I期79.2%升至本研究99.8%，达到该抗原既往间接ELISA报告值，同时保持高特异性98.0%；DOR为19,648，与LCA参考标准几乎完全一致（κ=0.98），表明原DAgS-ELISA敏感性不足反映试验配置问题，而非抗原向下形式的内在限制。棋盘滴定显著改善试剂使用，三种抗原包被量降至12.5 ng/well，偶联物稀释度较初始评估提高至多16倍，IBMP-8.2、IBMP-8.3和IBMP-8.4可稀释血清，降低成本并提高重复性而不损害诊断性能。单个抗原中，IBMP-8.4敏感性、准确性、DOR和κ最高，IBMP-8.3特异性和阳性似然比最高；联合应用时平行检测接近完美敏感性，串联检测保持特异性但降低敏感性。对于流行病学调查和筛查，IBMP-8.3/IBMP-8.4平行组合尤其有前景，并对应慢性恰加斯病需用两种不同原理试验确认的要求；敏感平行组合适合一线筛查和血库场景，串联特异性适合确认角色，且两种策略均依赖单一抗原向下平台，可简化并标准化当前双试验算法而无需粗制或半纯化寄生虫裂解物。交叉反应总体低，IBMP-8.4特异性最好；IBMP-8.3虽高度特异，但灰区比例最大，提示边缘反应可能性更高。研究人员提出高结合板固定抗原过程中新表位形成可能参与IBMP-8.3残留交叉反应，需进一步研究。IBMP-8.4完全无交叉反应，包括对Leishmania spp.和Schistosoma spp.，在共流行地区是决定性优势。IBMP-8.3灰区较大表明其更适合联合使用而非单独使用，通过复检不确定样本或与IBMP-8.4配对可减少不确定报告而不牺牲特异性。重复性中敏感性和AUC稳定，特异性在78.6–100%间变化；由于每复孔仅28份阴性血清，一份误分类会使特异性移动3.6个百分点，因此这些估计置信区间宽，不能替代全panel 399份阴性血清所得特异性。强阳性血清变异系数较高，尤其IBMP-8.1，是比例型反应指数的预期属性；分类取决于是否跨越阈值而非绝对指数值，故该不精密度未转化为敏感性损失。重复性仅在单板内评估，批间、操作者和批号间重现性仍需建立。研究限制包括仅检测慢性CD血清，未纳入急性期、先天病例和非人储存宿主标本；未评估偶联抗原在可变储存和运输条件下的长期稳定性；参考标准由LCA而非独立金标准定义，不能排除残余错分和融入偏倚；panel来自巴伊亚州单一区域参考实验室，可能限制向不同寄生虫谱系或抗体谱人群外推；回顾性病例对照结构可能相对连续诊断队列夸大准确性；抗原间差异未正式检验，AUC和配对比例未作统计比较，排名为描述性；未与商业化化学发光或重组ELISA平台进行头对头比较，偶联物长期和冻干稳定性仍待建立。未来研究应评估急性期和先天感染、现场动物储存宿主及与分子检测整合中的性能，以确定其在诊断算法和公共卫生监测项目中的作用；前瞻性多中心连续患者验证、与注册检测头对头比较、急性和先天感染及动物储存宿主评估以及冻干、自动化就绪格式开发，将是转化为常规诊断和监测使用的决定性步骤。研究结论部分翻译：重优化的IBMP-DAgS-ELISA与相同抗原的间接ELISA基准相当，同时检测总抗体，不依赖免疫球蛋白类别或宿主物种。IBMP-8.4单独或与IBMP-8.3联合，是慢性CD血清学的准确选择，并在完全定义的嵌合抗原基础上重建了双抗原夹心平台。