《Frontiers in Microbiology》：Development and preliminary validation of an omp25-based RPA-CRISPR/Cas12a visual assay for rapid screening of brucellosis-associated Brucella DNA
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布鲁氏菌病（brucellosis）仍是影响 livestock production 和 public health 的重要人兽共患病，因此需要设备要求有限的快速分子筛查方法。研究人员开发了一种靶向 Brucella omp25 基因 642-bp 区域的可
布鲁氏菌病（brucellosis）仍是影响 livestock production 和 public health 的重要人兽共患病，因此需要设备要求有限的快速分子筛查方法。研究人员开发了一种靶向 Brucella omp25 基因 642-bp 区域的可视化重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）-CRISPR/Cas12a 检测方法。采用比较序列分析评估靶标保守性，随后实验筛选了四对 RPA 引物和两个 CRISPR RNA（crRNA）。RPA3-crRNA1 产生最强的荧光反应，并用于检测优化。最终 Cas12a 反应含有 250 nM Cas12a、200 nM crRNA 和 200 nM 单链 DNA 荧光报告探针。RPA 扩增和 Cas12a 检测各需 20 min，阳性反应在 470-nm 蓝光下产生可见黄绿色荧光。实验 panel 中纳入的非靶标病原体未观察到交叉反应。与所选系统发育相关类群的计算机（in silico）比较发现，最终 RPA3 引物结合位点和 crRNA1 识别区域内存在序列差异，支持所检测类群基于序列交叉反应风险低的预测。使用纯化质粒 DNA，在实验条件下检测到的最低 DNA 浓度为 2.72 copies/μL 输入模板，相当于每个 RPA 反应约 13.6 copies。在常规监测采集的 96 份牛鼻拭子样本中，与 qPCR（quantitative real-time PCR，实时荧光定量 PCR）参比方法的一致性分析显示 93/96 份样本结果一致，阳性符合率（positive percent agreement, PPA）、阴性符合率（negative percent agreement, NPA）和总符合率（overall percent agreement, OPA）分别为 100.00%、93.75%和 96.88%；三个 qPCR 阴性样本显示弱 RPA-CRISPR/Cas12a 荧光，无法独立判定。由于目标区域在疫苗株 A19、S19 和 RB51 中保守，该检测旨在用于布鲁氏菌病相关 Brucella DNA 的初步筛查，而非物种鉴定或疫苗来源与野生型 DNA 的区分。在常规诊断应用前，需要用更多样本类型和特异性 panel 进行更广泛验证。
布鲁氏菌病（brucellosis）由 Brucella 属细菌引起，是重要的人兽共患病。在牛、羊、猪等家畜中，感染可导致流产、不育、睾丸炎、胎盘滞留和产奶量下降，造成畜牧业损失并持续构成公共卫生风险。人感染主要与直接接触感染动物、流产胎儿、胎盘、分泌物以及摄入未巴氏消毒奶制品有关，临床常见发热、盗汗、乏力和关节痛，并可转为慢性或复发。当前诊断主要包括细菌分离、血清学检测和分子检测。细菌分离特异性高，常被视为确证方法，但耗时长、存在生物安全风险并通常需要专门实验室设施。玫瑰红平板试验、标准试管凝集试验和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）广泛用于群体监测，但其表现可能受感染阶段、疫苗接种状态、样本质量和交叉反应抗体影响。PCR 和实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）可敏感检测 Brucella DNA，但通常依赖热循环和实验室荧光或电泳设备。因此，设备需求较低的快速分子筛查方法可能适用于兽医和资源有限场景。RPA（recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增）可在等温条件下快速扩增核酸，具有反应时间短和设备要求低等优势。CRISPR/Cas12a（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 12a，成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白12a）系统提供额外的序列依赖识别步骤：在 crRNA 引导识别含兼容前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）的靶标后，激活的 Cas12a 对单链 DNA（single-stranded DNA, ssDNA）报告探针表现出旁切活性。将 RPA 或相关等温扩增与 CRISPR 检测整合已用于多种病原体快速检测。已有用于布鲁氏菌分子检测的保守基因组靶标，其中 bcsp31 和 IS711 较常用，但 IS711 拷贝数和基因组分布在 Brucella 种和谱系间存在差异。omp25 基因编码 25-kDa 外膜蛋白，已在分子特征分析和快速扩增检测中受到研究。所选 642-bp omp25 区域在代表性经典 Brucella 序列中高度保守，含多个候选 RPA 引物结合区和 Cas12a 兼容 crRNA 靶点，可支持在明确蛋白编码位点内系统筛选引物-crRNA 组合。因此，本研究旨在评估 omp25 作为替代保守靶标与 RPA-CRISPR/Cas12a 工作流的兼容性。
研究人员首先评估代表性经典 Brucella 菌株中 omp25 靶区域的保守性，随后实验筛选 RPA 引物-crRNA 组合，建立并优化基于 omp25 的 RPA-CRISPR/Cas12a 可视化检测，评估其分析性能，并使用常规监测采集的牛鼻拭子样本与 qPCR 进行初步一致性评价。由于检测识别区域在疫苗株 A19、S19 和 RB51 中保守，该方法被定位为布鲁氏菌病相关 Brucella DNA 筛查，而非物种鉴定或疫苗来源与野生型 DNA 区分（differentiating infected from vaccinated animals, DIVA）。
关键技术方法概括不超过 250 字：研究人员从 GenBank 获取 Brucella abortus strain 2308 染色体 I 的 omp25 642-bp 区域（NC_007618.1:706319–706,960），构建 pUC19-omp25 阳性标准质粒。采用 SnapGene 对代表性 Brucella 序列及系统发育相关非经典 taxa 进行保守性和计算机（in silico）特异性比较。设计四对 RPA 引物和两个 crRNA，在耦合 RPA-CRISPR/Cas12a 系统中筛选，最终选择 RPA3-crRNA1。随后优化 Cas12a、crRNA 和 ssDNA 荧光报告探针浓度。开展实验特异性 panel、纯化质粒梯度分析灵敏度、牛鼻拭子样本一致性评价。牛鼻拭子队列来自中国宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心于 2026 年 5 月 11 日至 15 日开展的常规官方布鲁氏菌病监测，共 96 份。qPCR 作为参比方法，统计采用 one-way ANOVA 及 Tukey 或 Dunnett 多重比较，并计算 PPA、NPA、OPA 和 Cohen’s kappa。
研究结果如下。3.1 omp25 目标区域保守性：通过多序列比对发现，642-bp omp25 靶区域在代表性 Brucella 序列中总体高度保守。B. abortus 2308 参考序列与 B. abortus 544、S19、A19 和 RB51 对应区域无核苷酸差异；B. melitensis 16M 有 4 个错配，B. suis 1330 有 2 个错配，B. canis ATCC 23365 有 3 个错配，B. ceti DDEO02 有 2 个错配；B. ovis ATCC 25840 在 606 bp 范围内比对，有 3 个错配和 1 个 gap。变异分布于多个位置，部分重叠候选 RPA 引物结合或 crRNA 识别位点。总体上，642-bp 区域在疫苗株 A19、S19 和 RB51 中完全保守，支持这些菌株与检测识别区域的预测序列兼容性，但本研究未直接实验检测这些疫苗株，因此该靶标不能区分疫苗来源与野生型 Brucella DNA，不用于 DIVA。3.2 RPA 引物扩增：四对 RPA 引物均从 omp25 标准质粒扩增出预期大小产物，分别为 187、181、296 和 219 bp，因此均保留用于后续 crRNA 筛选。3.3 RPA 引物-crRNA 组合筛选：在相同 CRISPR/Cas12a 条件下评价 8 个引物-crRNA 组合，RPA2-crRNA1、RPA3-crRNA1 和 RPA3-crRNA2 产生明显荧光，其中 RPA3-crRNA1 端点荧光最高并用于后续优化；最终引物选择基于耦合系统性能而非琼脂糖凝胶条带强度。3.4 RPA-CRISPR/Cas12a 检测系统验证：只有 Cas12a 蛋白、crRNA、RPA 扩增产物和 ssDNA 报告探针同时存在时才产生强荧光信号，缺失任一核心组分均无有效荧光，说明所观察荧光需要四者同时存在。3.5 Cas12a 蛋白和 crRNA 浓度优化：在测试浓度矩阵中，20 μL 反应内 250 nM Cas12a 和 200 nM crRNA 产生最高端点荧光并具有清晰视觉信号，选为后续工作浓度。3.6 ssDNA 报告探针浓度优化：最终报告探针浓度至少 100 nM 时蓝光下可见荧光，端点荧光随浓度增加而升高；250 nM 端点信号最高，但 200 nM 视觉反应清晰，综合考虑信号表现和试剂消耗后选 200 nM。3.7 实验特异性：优化检测对 Brucella 阳性质粒产生清晰黄绿色荧光；牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV）、Chlamydia abortus、Salmonella Typhimurium、Listeria monocytogenes、Campylobacter fetus subsp. venerealis 和阴性对照无阳性荧光，未观察到交叉反应。3.8 omp25 目标区域计算机特异性：与 B. anthropi strain PBO、B. pseudogrignonensis strain ESL2、B. pituitosa isolate MPB25535 和 B. intermedia strain NCTC12171 同源区比较，发现多个错配和 gap，包括最终 RPA3 引物结合位点和 crRNA1 识别区域；Y. enterocolitica O:9 在所用 BLAST 条件下未发现与所选 omp25 靶区域显著核苷酸相似性。这支持所检测相关 taxa 基于序列交叉反应风险低的预测，但这些结果仅为计算机序列分析，未对这些相关 taxa 进行实验验证。3.9 分析灵敏度：纯化质粒从 2.72 × 10
10 至 2.72 × 10
0 copies/μL 十倍稀释后，端点荧光随浓度降低而下降；在 2.72 × 10
0 copies/μL 输入质粒浓度下仍可见荧光，端点信号高于阴性对照，三个独立反应重复均满足本研究阳性标准。由于每个 RPA 反应加入 5 μL 模板，该浓度相当于估计每个反应 13.6 copies 模板输入。因此，实验条件下检测到的最低 DNA 浓度为 2.72 copies/μL，相当于每个 RPA 反应约 13.6 copies；该值不是正式验证的检测限（limit of detection, LoD）。3.10 牛鼻拭子监测样本一致性：96 份牛鼻拭子样本平行用 RPA-CRISPR/Cas12a 和 qPCR 检测。qPCR 分类 48 份阳性、48 份阴性；48 份 qPCR 阳性样本 C
t 值为 33.21–38.99，中位数 36.70，四分位距（interquartile range, IQR）为 35.28–37.69。48 份 qPCR 阴性样本中 45 份无 C
t 值，3 份样本（Nos. 40、65、79）出现晚期数值 C
t 值 39.86、39.74 和 39.14，但缺乏特征性扩增曲线，因此归为阴性。RPA-CRISPR/Cas12a 分类 51 份阳性、45 份阴性；所有 48 份 qPCR 阳性样本均为 RPA-CRISPR/Cas12a 阳性；3 份样本（Nos. 25、81、82）qPCR 阴性但 RPA-CRISPR/Cas12a 显示弱视觉可辨荧光，归为不一致，其端点荧光分别为 158,777.03、133,858.17 和 153,885.39 RFU（relative fluorescence units，相对荧光单位）。由于无独立确认方法，这三份不一致样本真实状态无法解决。一致性分析显示 PPA 为 100.00%（95% CI：92.60–100.00%），NPA 为 93.75%（95% CI：82.80–98.69%），OPA 为 96.88%（95% CI：91.14–99.35%），Cohen’s kappa 系数为 0.938，表明两种方法强一致。这些指标描述与 qPCR 参比方法的一致性，不应解释为诊断灵敏度或特异性的确定估计。
讨论部分总结：早期快速筛查是家畜布鲁氏菌病防控和公共卫生风险管理的重要组成部分。研究人员开发的 omp25 靶向可视化 RPA-CRISPR/Cas12a 检测，其扩增和 CRISPR 检测步骤可在约 40 min 内完成，即 RPA 扩增 20 min 和 Cas12a 检测 20 min，阳性反应可在 470-nm 蓝光下可视化；该反应时间不包括样本制备、核酸提取和其他分析前流程。该研究的主要贡献不是引入 RPA-Cas12a 本身，而是评估保守 omp25 区域作为替代靶标、实验选择兼容的引物-crRNA 对，并在牛鼻拭子监测样本中进行初步一致性测试。分子靶标和引物-crRNA 组合选择强烈影响检测性能；RPA 在某些条件下可产生非特异产物，下游序列识别有价值。所有四对引物均产生可检测 RPA 产物，但只有部分引物-crRNA 组合产生强 Cas12a 荧光，RPA3-crRNA1 表现最佳，支持在完整耦合流程中筛选引物和 crRNA，而不应仅根据凝胶外观选择 RPA 引物。比较序列分析显示 omp25 靶区域在代表性经典 Brucella 序列中总体高度保守，但在一些候选寡核苷酸结合位点存在有限变异。最终 crRNA1 识别区域在所分析经典 Brucella 序列中保守，而最终 RPA3 引物位点在一些菌株中显示有限变异。实验检测开发、优化和分析评价使用源自 B. abortus 2308 的重组 omp25 质粒，因此序列保守性支持最终 RPA3-crRNA1 系统可能与其他 Brucella 序列兼容，但其他 Brucella 种的实际检测仍需用代表性基因组 DNA 或分离株确认。此外，未在相同实验条件下平行评价 bcsp31 和 IS711 靶向 RPA-CRISPR/Cas12a 检测，因此当前数据不能确定 omp25 在分析灵敏度、特异性或总体检测性能上更优；需要标准化头对头比较。纯化质粒条件下最低检测为 2.72 copies/μL 输入模板，相当于每个 RPA 反应约 13.6 copies；该值代表本研究所用纯化质粒条件下最低检测浓度，不应解释为正式验证的 LoD。正式 LoD 确定需在检测边界附近用预设统计标准重复测试。此外，基于质粒的实验未纳入核酸提取效率、潜在 DNA 丢失、基质相关抑制或其他分析前因素，因此不代表完整样本到结果工作流的灵敏度。既往 Brucella RPA 研究报告低拷贝分析检测和主要 Brucella 种多重区分，近期 CRISPR 辅助 Brucella 检测也使用荧光、视觉或侧向流读出实现低拷贝检测；由于靶序列、模板类型、扩增化学、报告格式和阳性标准不同，数值检测水平不应解释为直接等效。Cas12a 步骤通过 PAM 兼容性和 crRNA-靶标互补性在 RPA 扩增后提供序列依赖识别。实验特异性 panel 中 Brucella 阳性模板产生清晰荧光，而 IBRV、Chlamydia abortus、Salmonella Typhimurium、Listeria monocytogenes 和 Campylobacter fetus subsp. venerealis 保持阴性。计算机分析进一步发现所选相关非经典 taxa 存在多个差异，包括 RPA3 和 crRNA1 识别位点。由于阳性信号需要有效 RPA 扩增和后续 Cas12a 激活，这些序列差异支持所检测 taxa 交叉反应风险低的预测；然而，计算机错配模式不能替代湿实验室特异性测试，仍需包括系统发育相关 taxa 和诊断相关微生物的更广泛实验 panel。96 份牛鼻拭子样本采集自常规区域监测。鼻拭子采集快速、微创，在群体水平采样中操作方便，但不是确证诊断中全系列样本类型的既定替代。Brucella 分子检测可因样本类型和检测策略而异。在 96 份样本中，RPA-CRISPR/Cas12a 与 qPCR 参比方法对 93 份样本结果一致，PPA 100.00%，NPA 93.75%，OPA 96.88%，Cohen’s kappa 0.938。这些数据代表单一监测基质中的初步一致性评价，而非诊断性能的全面验证。仅评价了一种常规监测背景下的样本类型。三份 qPCR 阴性/RPA-CRISPR/Cas12a 阳性不一致样本无法用独立参考方法判定，因此不能确定其代表 RPA-CRISPR/Cas12a 假阳性、qPCR 假阴性、弱信号范围分析变异还是其他变异来源。端点荧光值也应谨慎解释；尽管 qPCR 阳性样本中通常观察到更强荧光，但个体样本 RFU 值有变异，且在低强度范围内定性组间存在部分重叠。因此，不能仅从当前数据集得出可靠端点 RFU 阳性截断值，临床样本分类基于相对于同批阴性对照的视觉荧光，而非仅 RFU。这种视觉读出对弱信号可能受观察者依赖变异影响，未来研究需要前瞻性验证的客观判读标准。因此，研究报告 PPA、NPA、OPA 和 kappa，而非针对确定性参考标准的诊断灵敏度和特异性。若干限制需要考虑：样本基质可影响核酸检测，因为不同样本类型的目标 DNA 产量、提取效率、抑制剂含量和基质相关背景可能不同。当前现场评价仅包括牛鼻拭子，因此其他布鲁氏菌病调查样本类型，包括血液、乳汁、阴道拭子和组织中的检测性能尚未建立。本研究未进行抑制剂加标或跨基质比较。湿实验室特异性 panel 有限，若干系统发育相关 taxa 仅通过计算机序列分析评价，而非实验测试。所选 omp25 靶区域在分析的疫苗株 A19、S19 和 RB51 序列中保守，因此该检测不应基于该靶标区分疫苗来源与野生型 Brucella DNA，不适用于 DIVA。最后，当前检测采用两步开管工作流，RPA 扩增产物需手动转移至后续 Cas12a 检测反应；扩增后开管增加扩增子气溶胶污染风险，可能影响其在分散或即时检测场景中的实用性。闭管或一锅法 RPA-CRISPR 形式已在其他病原体中开发，可能在未来检测开发中降低污染风险并提高现场适用性。
研究结论翻译：总之，基于 omp25 的 RPA-CRISPR/Cas12a 检测为布鲁氏菌病相关 Brucella DNA 的初步筛查提供了快速可视化工作流，并在所评估的牛鼻拭子监测样本中与 qPCR 显示高度一致性。当前证据支持分析验证和初步监测样本验证，而非广泛诊断验证、物种鉴定或疫苗/野生型区分。在常规应用前，需要进行更大规模评估，使用额外基质、更广泛特异性 panel、独立解决的不一致样本和闭管工作流。
