《Frontiers in Aging Neuroscience》：Clemastine alleviates Parkinson’s disease pathology by activating the AMPK/mTOR pathway and enhancing autophagic flux
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帕金森病是一种无法治愈的致残性神经退行性疾病，亟需新型疗法。本研究整合了综合性生物信息学分析与实验模型，探索Clemastine治疗帕金森病的潜力。生物信息学分析在多巴胺能神经元中鉴定出12种不同的细胞亚型和577个差异表达基因，以及167个潜在的帕金森病相关
帕金森病是一种无法治愈的致残性神经退行性疾病，亟需新型疗法。本研究整合了综合性生物信息学分析与实验模型，探索Clemastine治疗帕金森病的潜力。生物信息学分析在多巴胺能神经元中鉴定出12种不同的细胞亚型和577个差异表达基因，以及167个潜在的帕金森病相关Clemastine靶点。研究发现黑质中Braak分期与自噬相关基因表达之间存在显著相关性。在MPP+诱导的PC12细胞模型中，Clemastine处理增加了AMPK磷酸化水平，降低了mTOR Ser2448位点的磷酸化水平，表明AMPK被激活而mTOR活性降低；同时伴随α-突触核蛋白和p62水平降低，溶酶体标志物LAMP1和自噬体标志物LC3增加，以及细胞活力增强。即使在巴弗洛霉素A1存在下，Clemastine仍能提高LC3-II/LC3-I比值，表明其促进了自噬体的合成。相反，AMPK抑制剂Dorsomorphin阻断了Clemastine的作用，使mTOR磷酸化和α-突触核蛋白水平恢复。在慢性MPTP诱导的小鼠模型中，Clemastine给药增加了AMPK磷酸化水平，提高了LC3-II/LC3-I比值，并降低了mTOR磷酸化、p62和α-突触核蛋白水平。免疫荧光显示多巴胺能神经元和LC3斑点增加，同时磷酸化α-突触核蛋白减少。这些细胞和分子水平的改善与运动功能和非运动功能缺陷的缓解相一致。综上所述，研究结果表明Clemastine通过增加AMPK磷酸化和降低mTOR Ser2448磷酸化来减轻帕金森病病理，即激活AMPK通路并降低mTOR活性，从而通过促进自噬体的合成与降解来增强自噬通量，进而清除病理性α-突触核蛋白，改善神经元存活和行为症状。研究人员提出Clemastine是通过调节自噬治疗帕金森病的一种有前景的治疗候选药物。
一、研究背景与目的
帕金森病是一种常见于中老年人的神经退行性疾病，以黑质致密部多巴胺能神经元的进行性退变和路易小体的形成为特征，主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓等运动症状，以及抑郁、便秘等非运动症状。随着全球人口老龄化，帕金森病的患病率预计将持续上升。目前帕金森病的发病机制尚未完全阐明，涉及氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白质错误折叠等多种因素，其中α-突触核蛋白的异常聚集和自噬-溶酶体途径的功能障碍被认为是关键环节。现有治疗方法仅能缓解症状，无法阻止疾病进展，因此迫切需要开发新的治疗策略。
Clemastine作为一种H1抗组胺药，已被发现具有促进再髓鞘化和神经保护作用，并在帕金森病细胞模型中显示出增强自噬清除蛋白聚集体的潜力。基于此，本研究旨在通过整合生物信息学分析和体内外实验，系统探究Clemastine对帕金森病的治疗潜力及其潜在机制。
二、主要技术方法
研究人员从GEO数据库下载帕金森病患者中脑单细胞转录组数据，利用Seurat软件包进行细胞分型和差异表达基因分析；采用AlphaFold数据库获取人类蛋白质结构，使用AutoDock Vina进行Clemastine与22618种蛋白质的分子对接；利用Spearman相关性分析评估Braak分期与自噬基因表达的关系。体外实验使用MPP+诱导的PC12细胞模型，体内实验采用慢性MPTP诱导的帕金森病小鼠模型，通过Western blot、免疫荧光染色、旋转杆实验和粪便颗粒分析等方法进行评估。
三、研究结果
1. 单细胞细胞类型的鉴定
通过对5例帕金森病患者和6例健康对照者中脑样本的单细胞数据分析，共鉴定出星形胶质细胞、多巴胺能神经元、小胶质细胞等12种细胞类型。帕金森病组中小胶质细胞的比例显著高于健康对照组，提示小胶质细胞可能在帕金森病中脑病理过程中发挥重要作用。
2. 多巴胺能神经元差异表达基因分析
在多巴胺能神经元中共鉴定出577个差异表达基因，包括415个上调基因和162个下调基因。上调基因富集于突触功能和轴突形成等神经系统相关过程，下调基因富集于离子通道活性和神经递质代谢等信号传导过程。KEGG分析显示，上调基因富集于胆碱能、多巴胺能和谷氨酸能突触通路，下调基因富集于自噬和胆碱能突触通路。
3. Braak分期与自噬基因表达的相关性
在黑质中，38个自噬相关基因与Braak分期呈中度至强相关性，其中NFE2L2相关系数最高，MTOR呈负相关，表明自噬功能障碍可能是帕金森病进展的重要因素。
4. 分子对接分析
Clemastine与22618种蛋白质的分子对接结果显示，2474种蛋白质结合能低于-7 kcal/mol，其中包括152个自噬相关蛋白。潜在靶点的GO和KEGG分析富集于自噬、AMPK信号通路和多巴胺能突触等通路。
5. Clemastine激活PC12细胞中的AMPK/mTOR通路
在PC12细胞中，Clemastine处理显著增加p-AMPK/t-AMPK比值，降低p-mTOR/t-mTOR比值，表明AMPK被激活而mTOR活性降低。
6. Clemastine增强PC12细胞的自噬通量
在巴弗洛霉素A1存在下，Clemastine仍能提高LC3-II/LC3-I比值，表明其促进自噬体合成；同时Clemastine降低MPP+诱导升高的p62水平，表明其也促进自噬体降解。免疫荧光显示Clemastine增加了自噬体和自噬溶酶体的数量。
7. Clemastine减少α-突触核蛋白水平并改善细胞存活
Clemastine共处理显著降低了MPP+诱导的α-突触核蛋白升高，并部分改善了细胞活力。
8. Dorsomorphin抑制Clemastine的作用
AMPK抑制剂Dorsomorphin预处理可阻断Clemastine诱导的AMPK磷酸化增加和mTOR磷酸化降低，并逆转Clemastine对α-突触核蛋白的降低作用，证实Clemastine的作用依赖于AMPK/mTOR通路。
9. Clemastine在小鼠中脑激活AMPK/mTOR通路并增强自噬
在MPTP诱导的小鼠模型中，Clemastine显著增加p-AMPK/t-AMPK比值，降低p-mTOR/t-mTOR比值，提高LC3-II/LC3-I比值，降低p62和α-突触核蛋白水平。
10. Clemastine增加多巴胺能神经元中LC3并减少磷酸化α-突触核蛋白
免疫荧光显示，Clemastine处理增加了酪氨酸羟化酶阳性多巴胺能神经元中LC3斑点的数量，并显著减少了磷酸化α-突触核蛋白的水平。
11. Clemastine保护多巴胺能神经元并改善行为症状
Clemastine显著减轻了MPTP诱导的多巴胺能神经元丢失，改善了小鼠在旋转杆实验中的运动协调能力，并缓解了便秘样症状。
四、研究结论
本研究表明，Clemastine通过增加AMPK磷酸化和降低mTOR Ser2448位点磷酸化来激活AMPK/mTOR通路，从而增强自噬通量，促进病理性α-突触核蛋白的清除，改善多巴胺能神经元存活和行为症状。研究人员提出Clemastine是一种通过调节自噬治疗帕金森病的有前景的治疗候选药物。
