《Frontiers in Neurology》：Serum MGP and ECP are commonly elevated in first-onset and recurrent ischemic stroke: a two-phase DIA proteomic study in a Chinese cold-region cohort
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专业术语翻译（摘要部分）
背景： 缺血性卒中（ischemic stroke, IS）具有高复发率，但用于区分首发与复发性缺血性卒中的有效生物标志物仍然有限。本研究旨在鉴定在首发与复发性缺血性卒中中共同升高的血清蛋白质组学标志物，并评估其在中国寒地人群中区分各
专业术语翻译（摘要部分）
背景： 缺血性卒中（ischemic stroke, IS）具有高复发率，但用于区分首发与复发性缺血性卒中的有效生物标志物仍然有限。本研究旨在鉴定在首发与复发性缺血性卒中中共同升高的血清蛋白质组学标志物，并评估其在中国寒地人群中区分各疾病状态与健康对照的能力。
方法： 研究分两阶段开展。在发现阶段，采用数据非依赖采集（Data-Independent Acquisition, DIA）蛋白质组学技术分析了10例首发缺血性卒中患者、10例复发性缺血性卒中患者和10例健康对照；验证阶段将样本量扩大至49例首发缺血性卒中患者、30例复发性缺血性卒中患者和50例健康对照。差异表达蛋白定义为倍数变化（fold change, FC）≥1.5或≤0.67。研究人员采用校正年龄和性别的多变量Firth惩罚逻辑回归构建诊断模型，数据按2:1随机分为训练集和测试集进行受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析。
结果： 鉴定出两个核心蛋白：基质Gla蛋白（matrix Gla protein, MGP）和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（eosinophil cationic protein, ECP）。与健康对照相比，两者在首发和复发性缺血性卒中组中均显著升高（均p < 0.05）。两个独立的逻辑回归模型分别将首发缺血性卒中（测试集AUC 0.993）和复发性缺血性卒中（测试集AUC 0.959）与健康对照区分开来，并经重复10折交叉验证确认；两个蛋白在患者组之间无显著差异。对其相互作用伙伴的富集分析揭示了中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap, NET）形成、炎症反应和免疫调节的参与。
结论： 血清MGP和ECP在首发和复发性缺血性卒中中均共同升高，两个独立的组合模型能以高准确性区分各疾病状态与健康对照。该生物标志物组合覆盖三个核心病理过程——动脉粥样硬化和血管钙化、慢性炎症及高凝状态——为疾病状态表征和风险分层提供了候选生物标志物，值得进一步研究，尤其是在高纬度寒地人群中。
论文解读文章
一、研究背景与问题
缺血性卒中（ischemic stroke, IS）是常见的脑血管疾病类型，全球每年约79.5万人发生卒中，其中76.7%为首发、23.3%为复发。在中国，2019年新发卒中394万例、死亡219万例。寒冷暴露可通过促炎和血小板激活通路增加脑梗死风险。尽管抗血小板、抗凝及血压、血糖、血脂的综合管理在一定程度上降低了复发率，但2015—2018年中国调查显示脑梗死后1年内复发率仍达12.5%，已成为严重的公共卫生问题。
首发与复发性缺血性卒中不应被视为同一疾病过程的两个阶段：复发病例的死亡率、残疾程度、住院时间和医疗费用均更高，需要加强二级预防和密切随访；首发病例则需要准确的风险分层以预防复发。两者的临床意义不同：首发诊断侧重于急性期识别，复发预测与监测涉及二级预防和预后管理。
目前区分首发与复发性缺血性卒中几乎完全依赖病史和神经影像学检查，但该方法存在显著局限：静默性脑梗死可能未被检出导致复发风险被低估；病史常不完整或不可靠，尤其在老年患者或急性期；影像学无法揭示决定复发风险的血管和循环系统潜在病理生理状态。尽管已有证据表明血液生物标志物可用于追踪复发性卒中的长期风险，但尚未建立表征首发和复发性缺血性卒中分子特征或监测复发风险的血清蛋白组合，且两种疾病状态是否共享共同的血清蛋白质组改变仍不明确。
既往报道的标志物如胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）和心脏型脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid-binding protein, FABP）主要反映卒中发作后的急性实质损伤，而非决定复发的慢性血管和免疫过程。Zhang等人的研究虽采用DIA发现和靶向MRM验证，识别了TAGLN2、ITGAM、MYL9、RSU1和COL1A2等与缺血性卒中复发相关的亚型依赖性蛋白特征，但多数既往研究仅针对单一类型缺血性卒中的发生或亚型，而非反映首发与复发事件之间的生物学差异。目前尚无研究在同一队列中比较首发与复发性缺血性卒中患者的血清蛋白谱，也未在中国黑龙江人群中进行首发与复发性脑梗死的专门比较蛋白质组学分析。
新兴证据表明，血管钙化是与斑块不稳定和血栓形成密切相关的活跃调控过程；基质Gla蛋白（matrix Gla protein, MGP）是维生素K依赖性动脉钙化抑制剂，与颈动脉斑块钙化和脑血管疾病不良预后相关，功能性MGP基因变异增加缺血性卒中易感性。嗜酸性粒细胞介导的炎症已成为动脉粥样硬化血栓形成的重要因素：嗜酸性粒细胞活化释放的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（eosinophil cationic protein, ECP）与颈动脉斑块存在和卒中发生率相关。中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap, NET）形成促进免疫血栓形成，急性缺血性卒中患者血栓和循环中NET负荷升高。动脉粥样硬化、慢性炎症和高凝状态这三个过程是首发与复发性缺血性卒中可能差异的候选病理生理轴，但反映这些轴的循环蛋白在首发和复发性脑梗死中是共同改变还是差异改变仍属未知。
二、研究内容与结论
本研究采用基于数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）的血清蛋白质组学技术，系统分析了中国寒地（黑龙江省，约北纬47°—53°）人群的血清蛋白质组。研究采用两阶段独立队列设计，结合逻辑回归与ROC分析构建联合诊断模型，旨在鉴定在首发和复发性缺血性卒中中均升高的血清蛋白，并构建和验证区分各疾病状态与健康对照的独立诊断模型。研究发现了MGP和ECP两个核心蛋白，两者在首发和复发性缺血性卒中组中均显著高于健康对照，两个独立逻辑模型分别以测试集AUC 0.993和0.959的高准确性区分首发和复发性缺血性卒中与健康对照，且两蛋白在患者组间无显著差异。该生物标志物组合覆盖缺血性卒中的三个核心病理过程——动脉粥样硬化和血管钙化、慢性炎症及高凝状态，为疾病状态表征和风险分层提供了候选生物标志物，是该寒地人群中首次针对首发与复发性脑梗死进行的比较血清蛋白质组学分析。
三、关键技术方法
研究采用两阶段独立队列设计：发现阶段（2019—2020年，n=30）和扩大验证阶段（2021—2023年，n=129），样本均来自同一地区（齐齐哈尔，约北纬47°），两阶段在采血、凝血、离心、保存、FASP酶解和质控方面完全一致，由同一机构和实验室采用相同标准操作程序和LC-MS/MS平台完成。发现阶段使用Orbitrap Exploris 480质谱仪联用Ultimate 3000 UHPLC系统。差异表达蛋白定义为倍数变化≥1.5或≤0.67，采用Benjamini-Hochberg校正。蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）分析使用STRING数据库（版本12.0），以智人（Homo sapiens）为物种，综合置信分数阈值0.4，GO和KEGG通路富集分析使用Metascape。统计使用R软件（4.3.2版），采用方差分析、Firth惩罚逻辑回归、ROC分析和重复10折交叉验证评估模型性能。
四、研究结果
3.1 三组基线人口学和临床特征： 与健康对照相比，首发和复发组的年龄、收缩压和舒张压均显著升高（均p < 0.001），三组BMI无显著差异。高血压和糖尿病被视为缺血性卒中的结果或伴随特征而非独立暴露，未纳入协变量，仅校正年龄和性别。
3.2 发现阶段差异蛋白质组学分析： 共纳入30人，DIA分析鉴定384个蛋白，5个质控重复样本的相关性R2=0.985，保留296个CV<0.5的蛋白。PLS-DA评分图显示三组蛋白质组特征显著不同。以FC≥1.5或≤0.67且BH校正p < 0.05为阈值，首发组鉴定24个蛋白，复发组鉴定23个蛋白，其中15个为两组共有。
3.3 扩大验证阶段差异蛋白质组学分析： 共纳入129人，4个质控重复样本相关性R2=0.986，OPLS-DA能清晰区分三组。首发组鉴定128个蛋白，复发组鉴定81个蛋白，59个为共有。基于150个缺血性卒中相关差异表达蛋白的热图显示三组样本蛋白谱不同。
3.4 首发缺血性卒中生物标志物筛选与模型组合： 两阶段Venn图整合显示首发相关蛋白12个、复发相关蛋白11个。首发相关蛋白中筛选出6个上调蛋白（IGKV1-39、SLPI、MGP、THIO、ECP、组蛋白H1.5），其中MGP、ECP和H1-5在训练集和测试集中AUC均≥0.8。单标志物模型中MGP（校正OR per SD 52.7，95% CI 9.0—309.5）和ECP（校正OR per SD 5.2，95% CI 2.4—11.5）均与首发缺血性卒中显著相关（均p < 0.001）。H1-5在联合模型中无独立关联（校正OR per SD 2.5，95% CI 0.8—7.9，p = 0.126），加入后未显著改善区分性能（配对DeLong检验p = 0.327），故排除。最终联合模型纳入MGP、ECP、年龄和性别，测试集AUC 0.993（95% CI 0.975—1.000），敏感性100.0%，特异性94.1%；重复分层10折交叉验证确认模型稳定（平均折AUC 0.985 ± 0.029）。
3.5 复发性缺血性卒中生物标志物筛选与模型组合： 复发相关11个差异表达蛋白中最终保留与首发一致的MGP、ECP和H1-5。校正年龄和性别后，MGP在最终模型中仍与复发性缺血性卒中显著相关（校正OR per SD 96.6，95% CI 1.7—5.4×103，p = 0.026），ECP和H1-5呈阳性但非显著关联，可能反映复发例数有限（n=30）。将ECP或H1-5加入MGP未改善区分性能（配对DeLong p = 0.281和0.277），为避免过拟合，最终采用MGP单标志物模型。年龄与复发性缺血性卒中独立相关（校正OR 1.38/年，95% CI 1.10—1.72）。测试集AUC 0.959（95% CI 0.884—1.000），敏感性90.0%，特异性94.1%；重复10折交叉验证平均折AUC 0.993 ± 0.024。
3.6 两蛋白在首发与复发组间的表达差异： 在两个阶段中，MGP和ECP在首发组和复发组的表达水平均显著高于对照组（均p < 0.001），但两蛋白在首发组与复发组之间无显著差异。
3.7 蛋白-蛋白相互作用与通路富集分析： MGP中心网络包含10个相互作用伙伴（PROS1、GGCX、VKORC1、BGLAP、ABCC6、BMP2、SPP1、ELN、AHSG、UCMA），ECP中心网络包含10个相互作用伙伴（RNASE2、IL5、EPX、PRG2、ELANE、MPO、MS4A3、AZU1、CTSG、ANG）。22个蛋白的富集分析显示，生物学过程富集于对细菌的防御反应、生物矿化及其调控；细胞组分富集于囊泡腔、细胞质囊泡腔和分泌颗粒腔；分子功能富集于硫化合物结合、糖胺聚糖结合和肝素结合；KEGG通路分析鉴定出中性粒细胞胞外陷阱形成、哮喘和泛醌及其他萜类醌生物合成。
五、讨论与结论
讨论部分： 本研究发现MGP和ECP在首发和复发性缺血性卒中中均能有效区分各疾病状态与健康对照，且两蛋白在首发与复发组间无显著差异，表明两种疾病状态表现出共同的炎症/血栓形成相关特征升高而非特异性区别。在生物学层面，MGP是血管平滑肌细胞、软骨细胞和内皮细胞表达的维生素K依赖性动脉钙化抑制剂，MGP功能受损与血管钙化、动脉僵硬度及脑血管预后相关；ECP在嗜酸性粒细胞活化时释放并可介导血小板聚集，嗜酸性粒细胞浸润已在动脉粥样硬化病变中被证实。ECP的多个相互作用伙伴（如ELANE、MPO、CTSG、PRG2、AZU1）为中性粒细胞/嗜酸性粒细胞颗粒蛋白，KEGG分析中NET形成的富集与缺血性卒中后脑循环中超急性NET形成的近期证据一致，NET形成进而促进凝血激活，将本组合捕获的炎症特征与急性缺血性卒中特征性高凝状态联系起来。动脉粥样硬化和血管钙化、慢性炎症及高凝状态这三个过程为两蛋白在两种疾病状态中共同升高提供了连贯的工作假说。寒地背景应视为人群背景描述而非寒冷特异性机制的证据。研究局限性包括：单中心发现阶段研究、样本量适中、尚未在不同机构或地理区域的外部队列验证、横断面设计无法进行生物标志物与卒中复发之间的因果推断、两患者组在分别归一化的DIA批次中定量导致无法构建统计学上有效的首发-复发直接比较模型、原始建模流程在用于最终模型评估的同一数据上进行了特征筛选。
结论部分： 本研究采用液相色谱-串联质谱法在血清中鉴定出MGP和ECP。这两个蛋白构成高效的生物标志物组合，其价值在于覆盖缺血性卒中的三个核心病理过程：动脉粥样硬化和血管钙化、慢性炎症及高凝状态。由这两个蛋白衍生的两个逻辑回归模型能以高准确性区分各疾病状态（首发和复发性缺血性卒中）与健康对照，而两蛋白的血清水平在两种疾病状态之间无显著差异。该组合为缺血性卒中的疾病状态表征和风险分层提供了候选生物标志物，值得在更大规模的多中心队列中进一步验证。
