反胶束（RM）中治疗性蛋白递送：表面活性剂化学对HRP、ELA与PAP载荷稳定性的系统比较

《International Journal of Pharmaceutics》：Therapeutic protein delivery in reverse micelles: influence of surfactant chemistry on payload stability

反胶束（RM）已成为用于亲水性生物分子脂化的多功能超分子组装体，促进其整合入脂质基药物递送系统。然而，表面活性剂化学对RM内蛋白稳定性的影响仍知之甚少。在本研究中，研究人员系统研究了代表阴离子、阳离子、两性离子和非离子头基类别的十种表面活性剂库，以建立结构-稳定性关系。在测定反临界胶束浓度（rCMC）后，通过干法加载将辣根过氧化物酶（HRP）、弹性蛋白酶（ELA）和木瓜蛋白酶（PAP）包封入RM。在48 h内评估蛋白载荷、分配行为和结构完整性，同时采用独立的Zein（玉米醇溶蛋白）荧光测定验证表面活性剂诱导的蛋白变性。尽管所有表面活性剂均形成稳定RM并实现成功蛋白包封，但观察到蛋白保护方面存在显著差异。在三种蛋白中，建立了一致的变性排序（DDAB > SLES > SOS > AOT > DEHP > So-Myr > SL > P2-OE > SMO > PG-3），表明表面活性剂化学是RM内蛋白稳定性的重要决定因素之一。该排序由Zein测定独立确认，并在替换连续油相后保持不变，表明蛋白变性主要源于表面活性剂依赖性界面相互作用，而非周围油相。这些发现为蛋白兼容的反胶束制剂中表面活性剂的合理选择建立了系统框架，并为生物制剂脂质基药物递送系统的开发提供了实用设计原则。

论文解读

作者为 Melanie Lena Ebert、Alessa Sabrina Thomé、Khush Bakhat Afzal 和 Andreas Bernkop-Schnürch。研究背景方面，肽和蛋白因高特异性和效力成为快速增长的治疗类别，但其口服递送受物理化学不稳定性、酶降解和膜渗透性差限制。脂质基和含表面活性剂递送系统被广泛探索以提高稳定性并促进吸收。反胶束（reverse micelles, RM）是一类由表面活性剂在非极性连续相中自组装形成的超分子组装体，具有纳米级亲水核，可包载亲水生物分子并促进其整合入脂质基口服药物递送系统。然而，表面活性剂可与蛋白相互作用，诱导从部分解折叠到完全变性的构象变化；在RM中，蛋白可能同时受限域稳定和界面相互作用去稳定。系统研究不同表面活性剂类别对RM内蛋白稳定性影响仍较稀缺。因此，研究人员旨在系统考察表面活性剂诱导的RM内蛋白变性，建立结构-稳定性关系，为蛋白兼容RM制剂的合理选择提供依据。

研究人员建立了十种代表不同化学类别和分子架构的表面活性剂库，包括硫酸盐（SO₄^?）、碳水化合物衍生的非离子山梨坦酯（SMO）、羧酸盐（COO^?）、季铵盐（NR₄⁺）、聚甘油酯（PG-3）、聚乙二醇醚（P2-OE）、磷酸酯（PO₄^?）、磺基琥珀酸酯（SO₃^?）、醚硫酸盐（SLES）和两性离子/两亲性磷脂（SL）。选用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）、弹性蛋白酶（elastase, ELA）和木瓜蛋白酶（papain, PAP）作为模型治疗相关蛋白，并以玉米醇溶蛋白（Zein）作为非酶模型。研究得出，所有表面活性剂均能形成稳定RM并成功包载蛋白，但蛋白保护差异显著，并建立一致性变性排序：DDAB > SLES > SOS > AOT > DEHP > So-Myr > SL > P2-OE > SMO > PG-3。非离子表面活性剂PG-3、SMO、P2-OE保护最强，阳离子DDAB和阴离子SLES去稳定最强。包封效率与结构保持并不直接相关。该研究为生物制剂脂质基递送系统中表面活性剂的理性选择提供了系统框架。

方法概括（不超过250字）：研究人员以十种化学多样表面活性剂构建库，用7,7,8,8-四氰基对醌二甲烷（TCNQ）增溶法测定在肉豆蔻酸异丙酯（IPM）或异十六烷基硬脂酸酯（ICS）中的反临界胶束浓度（reverse critical micelle concentration, rCMC）；采用干法加载将HRP、ELA、PAP包载入RM；以反相高效液相色谱（RP-HPLC）在6、12、24、48 h定量载荷；测定6 h分布系数（LogD_RM/water）评估分配；用1 M KCl破乳回收蛋白，并以邻苯二胺（OPD）、MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide和偶氮酪蛋白（azocasein）酶活法计算活性蛋白比例；另进行水介质孵育、ICS油相控制、Zein内源色氨酸荧光验证及模拟肠液保护实验。本研究未涉及样本队列来源。

研究结果方面：

3.1 表面活性剂库设计与反临界胶束浓度（rCMC）测定。通过TCNQ增溶法，十种表面活性剂均形成RM，rCMC为0.74–2.48% (w/w)，其中So-Myr最低，P2-OE最高。后续统一采用2.5% (w/w)，超过所有rCMC。结论是表面活性剂化学和分子架构影响反胶束自组装效率。

3.2 蛋白加载入反胶束。通过干法加载和HPLC定量，HRP、ELA、PAP均成功包载入所有RM，载荷随时间增加。AOT对HRP和PAP载荷最高，P2-OE对ELA最高，DDAB常最低。结论是载荷受蛋白身份和表面活性剂化学共同影响，高载荷不等于高稳定性。

3.3 反胶束中蛋白分配行为。6 h LogD_RM/water均为正，表明蛋白保留于RM相；DDAB最低，SMO、DEHP、AOT较高。LogD与载荷不直接相关。结论是分配行为与结构保持是相关但不同的界面过程。

3.4 HRP在反胶束中的变性。通过OPD酶活与HPLC总蛋白比较，PG-3、SMO、P2-OE、SL保护最好，DDAB、SLES、SOS、AOT去稳定最强。48 h时PG-3保留94.4%，DDAB仅28.7%。结论是表面活性剂化学显著影响HRP结构保持。

3.5 ELA在反胶束中的变性。通过MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide酶活测定，ELA整体较HRP稳定，但排序相似：PG-3、SMO、P2-OE、SL保护最好，DDAB、SLES最差。48 h时PG-3保留96.9%，DDAB保留24.6%。结论是表面活性剂依赖趋势可重复，损失幅度受蛋白特性调节。

3.6 PAP在反胶束中的变性。通过azocasein酶活测定，PAP再现HRP和ELA趋势：PG-3、SMO、P2-OE保护最好，DDAB和SLES最差。48 h时PG-3保留96.9%，DDAB和SLES分别约36.6%和36.0%。结论是三种结构不同蛋白均支持表面活性剂化学对稳定性的稳健影响。

3.7 连续油相对蛋白包封和变性的影响。用ICS替换IPM并选择SMO、DEHP、SLES，载荷相近，变性排序不变：SMO保护最好，SLES最差，DEHP居中。结论是油相可影响幅度，但不是相对表面活性剂趋势的主要决定因素；头基化学、疏水域和整体架构贡献不能完全分离。

3.8 表面活性剂在水介质中对蛋白稳定性的影响。在相应缓冲液中以1% (w/v)表面活性剂孵育48 h，非离子PG-3、SMO、P2-OE活性保持较高，DDAB和SLES最低，趋势与RM中一致。结论是直接表面活性剂-蛋白相互作用显著贡献失活，RM界面可调节或放大会这些作用。

3.9 Zein测定对表面活性剂变性的独立验证。通过Zein内源色氨酸荧光，60 min内DDAB变性最强，SLES、SOS、AOT次之，PG-3、SMO、P2-OE保护最好。结论是该独立非酶测定与三种酶结果一致，支持表面活性剂化学是蛋白稳定性的重要决定因素。

讨论部分总结认为，表面活性剂化学，尤其头基依赖的界面性质，是RM内蛋白稳定性的重要贡献因素；包封、分配和稳定性是相关但不同的过程。阳离子DDAB和阴离子SLES与蛋白暴露残基发生静电和疏水相互作用，可扰动天然构象；高水合非离子表面活性剂界面较温和。Zein测定、水介质实验和油相控制支持直接表面活性剂-蛋白相互作用及RM界面组织的作用。局限性包括：仅使用三种模型蛋白，活性保持被用于推断结构完整性而非直接结构表征；表面活性剂疏水域、分子大小和整体架构不同，无法完全分离头基效应；RM为简化模型，共表面活性剂、脂质和生物介质可能进一步影响稳定性；研究未优化每种蛋白的最佳RM制剂。

研究结论翻译：本研究利用包含十种不同化学类别和分子架构表面活性剂的库，系统阐明表面活性剂化学对反胶束内蛋白稳定性的影响。通过整合rCMC测定、蛋白包封、分配行为、定量活性分析、油相控制和独立Zein变性测定，研究人员评估了广泛界面环境下表面活性剂特征与蛋白稳定性的关系。尽管所有表面活性剂均成功形成稳定反胶束并有效包封HRP、ELA和PAP，但其对蛋白催化活性和推断完整性的影响差异显著。跨三种模型蛋白建立高度一致的变性排序：DDAB > SLES > SOS > AOT > DEHP > So-Myr > SL > P2-OE > SMO > PG-3，揭示所研究表面活性剂化学间显著且可重复的蛋白稳定性差异。该排序得到Zein测定支持，并在替换连续油相后大体不变，表明表面活性剂依赖的相对趋势对所研究油相变化稳健，但不能排除油相特异性效应。结果进一步表明，有效包封和有利分配不一定与催化活性保持相关；具有可比反胶束性质的表面活性剂对蛋白稳定性影响根本不同。非离子PG-3、SMO和P2-OE一致提供最高程度蛋白保护，而阳离子季铵盐DDAB和阴离子醚硫酸盐SLES在所有蛋白系统中诱导显著催化活性损失。研究承认，该排序源于三种结构和功能不同的模型蛋白，可能不能完全代表更大或结构更复杂的治疗性蛋白；蛋白完整性由催化活性保持推断而非直接结构表征，因此不立即损害催化功能的细微构象变化可能未检测；表面活性剂疏水域、分子大小和整体架构不同，无法完全分离各结构特征贡献；RM系统为简化模型，其他制剂变量可能进一步影响稳定性；本研究未设计识别或优化每种蛋白的最佳RM制剂，而是系统比较不同表面活性剂化学以阐明标准化条件下趋势。尽管如此，所有蛋白和互补实验方法中观察到的一致性表明表面活性剂依赖趋势可重复，并支持表面活性剂化学，包括头基依赖界面性质，是重要贡献因素。总体而言，本研究为基于蛋白稳定性质合理选择表面活性剂提供了系统实验框架，并强调表面活性剂化学是开发蛋白兼容反胶束药物递送系统的重要设计参数。