《JACC: Basic to Translational Science》：Single-Cell Transcriptomics Reveals the Immune Pathogenesis of Isolated Coronary Arteritis Presenting as Refractory In-Stent Restenosis
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难治性复发性支架内再狭窄（refractory recurrent in-stent restenosis, RISR）以既往治疗病变处管腔狭窄的频繁持续复发为特征，已成为当代介入心脏病学面临的重大挑战。随着接受经皮冠状动脉介入治疗（percut
摘要专业翻译
难治性复发性支架内再狭窄（refractory recurrent in-stent restenosis, RISR）以既往治疗病变处管腔狭窄的频繁持续复发为特征，已成为当代介入心脏病学面临的重大挑战。随着接受经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention, PCI）人群的迅速扩大，RISR已不再是罕见的临床现象。患者通常需要在短期内反复接受靶病变血运重建，报道的2年靶病变血运重建率超过50%。此外，靶病变常解剖复杂，多涉及严重钙化或慢性完全闭塞，使临床处理极为困难。四分之一的患者入院时表现为急性冠脉综合征，最终预后不良。包括反复介入、血管内近距离放射治疗、旋磨术以及强化降脂降糖治疗在内的传统策略均未能阻断再狭窄复发的恶性循环，提示RISR不太可能仅代表单纯的机械性失败或动脉粥样硬化驱动过程。在此背景下，冠状动脉炎值得作为潜在机制加以考虑。
冠状动脉炎通常指继发于自身免疫性疾病或系统性血管炎的冠状动脉受累，最常见于系统性红斑狼疮、大动脉炎、巨细胞动脉炎、结节性多动脉炎和IgG4相关性疾病。它已被公认为支架内再狭窄（in-stent restenosis, ISR）的独立危险因素，也是非动脉粥样硬化性心肌缺血、心肌梗死甚至心源性猝死的病因。然而近年来，多篇病例报告描述了一种独特的临床表型，即血管炎仅局限于冠状动脉，被定义为孤立性冠状动脉炎（isolated coronary arteritis, ICA）。这些患者未检测到系统性受累，血清自身抗体和炎症标志物（如红细胞沉降率）均正常。频繁发作的RISR是促使评估的首个典型临床表现。影像学结果支持炎症假说：正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（positron emission tomography/computed tomography, PET/CT）显示支架段示踪剂摄取增加，冠状动脉计算机断层扫描血管造影显示血管周围脂肪衰减指数升高，有时甚至伴有血管周围软组织增厚。这些病变对常规血运重建或强化动脉粥样硬化性心血管疾病导向治疗反应不佳，而一些探索性病例提示糖皮质激素或免疫抑制治疗可能获益，进一步提示其存在不同于传统ISR的免疫炎症机制。
传统ISR的决定因素主要涉及机械性和生物学因素，支架扩张不充分被认为是首要原因。然而，当代实践的进步已大幅改善这一问题。病理学上，ISR通常归因于两大过程：早期与机械性血管损伤后的新生内膜增生相关；晚期主要归因于延迟内皮修复继发的新生动脉粥样硬化，通常发生在支架植入1年以上。这两种病理过程可通过血管内超声（intravascular ultrasound, IVUS）或光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）加以区分。根据已发表文献和研究人员既往的血管内观察，ICA-RISR病变主要由致密纤维性新生内膜构成，提示持续的炎症激活以及异常的血管平滑肌细胞迁移、增殖和表型转换，与RISR在1年内发生的临床病程一致。
综上所述，在日益增多的PCI人群中，ICA-RISR已成为一个关键问题，但缺乏精确的机制研究和系统的免疫学框架，使临床管理极具挑战性。即使冠状动脉旁路移植术也不能消除风险，因为持续的血管炎症使患者易发生早期移植物衰竭和不良心血管事件。
在此背景下，本研究创新性地直接从表现为RISR的孤立性冠状动脉炎（ICA-RISR）患者罪犯病变处采集冠状动脉血液样本，并进行单细胞RNA测序以描绘局部免疫景观。研究人员进一步整合了体外功能实验和体内血管导丝损伤模型来验证关键分子通路，旨在阐明ICA驱动RISR的免疫发病机制，并确定潜在的治疗靶点。
论文解读
一、研究背景与目的
难治性复发性支架内再狭窄（refractory recurrent in-stent restenosis, RISR）以同一靶病变处管腔狭窄的频繁持续复发为特征，已成为当代介入心脏病学面临的重大挑战。随着接受经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention, PCI）人群的迅速扩大，RISR患者通常需在短期内反复接受靶病变血运重建，2年靶病变血运重建率超过50%，且靶病变常涉及严重钙化或慢性完全闭塞，临床处理极为困难。传统策略包括反复介入、血管内近距离放射治疗、旋磨术及强化降脂降糖治疗，均未能阻断再狭窄复发的恶性循环，提示RISR并非单纯的机械性失败或动脉粥样硬化驱动过程。近年来，多篇病例报告描述了一种血管炎仅局限于冠状动脉的独特临床表型，即孤立性冠状动脉炎（isolated coronary arteritis, ICA）。此类患者无系统性受累，血清自身抗体和炎症标志物正常，但以频繁发作的RISR为首发表现，影像学显示支架段炎症征象，且对常规治疗反应不佳，提示其存在独特的免疫炎症机制。然而，ICA-RISR缺乏精确的机制研究和系统的免疫学框架，临床管理极具挑战性。本研究旨在通过单细胞转录组学系统阐明ICA-RISR的免疫发病机制，并确定潜在的治疗靶点。
二、研究内容与主要结论
研究人员创新性地从ICA-RISR患者罪犯病变处直接采集冠状动脉血液样本，对10例RISR患者和10例非ISR患者（定义为支架植入后至少1年造影确认通畅）的冠状动脉血单个核细胞（coronary blood mononuclear cells, CBMCs）进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），并在独立验证队列（8例RISR和8例非ISR）中验证关键分子发现，同时结合体外功能实验和体内小鼠颈动脉导丝损伤模型，系统阐明了ICA-RISR的免疫病理机制。研究发现，单核细胞中AP-1转录因子复合物的异常激活是ICA-RISR的核心转录特征，CCR1/p38 MAPK/AP-1/炎症因子轴是驱动持续性血管炎症和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）功能异常进而导致新生内膜增生的中枢机制。该研究将RISR从单纯的机械性并发症重新定义为机制明确的炎症性疾病，为精准免疫治疗开辟了新途径。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）：采用10× Genomics平台对冠状动脉血单个核细胞（CBMCs）进行5′转录组测序，通过Cell Ranger、Seurat等工具进行数据处理、聚类和差异表达分析；2）单细胞调控网络推断与聚类分析（SCENIC）：推断转录因子与靶基因的共表达调控网络并量化转录因子活性；3）基因集富集分析（GSEA）：基于分子特征数据库（MSigDB）评估单核细胞中差异富集的生物学通路；4）拟时间轨迹分析和RNA速率分析：分别使用Monocle2和scVelo推断细胞分化轨迹和转录动态；5）细胞间通讯分析：使用CellPhoneDB和CellChat分析配体-受体相互作用；6）流式细胞术分选与分析、Western blot、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附测定（ELISA）等分子验证手段；7）体外共培养实验：采用Transwell系统将RISR或非ISR患者来源的单核细胞与人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMCs）共培养，通过EdU染色、Transwell迁移实验和划痕愈合实验评估VSMC增殖和迁移能力；8）体内小鼠颈动脉导丝损伤模型：通过AAV载体实现单核细胞特异性Fos基因条件敲低，验证AP-1在新生内膜增生中的因果作用。样本队列来源包括阜外医院（中国医学科学院和北京协和医学院）的发现队列（10例RISR和10例非ISR）和验证队列（8例RISR和8例非ISR），所有RISR患者同时纳入抗炎临床试验（NCT06090890）。
四、研究结果
1. scRNA-seq揭示RISR患者冠状动脉血液的免疫景观
通过对20份样本共151,424个高质量CBMCs进行无监督聚类分析，研究人员鉴定出9大主要细胞类型：T细胞（33.21%）、自然杀伤（natural killer, NK）细胞（15.72%）、B细胞（13.55%）、中性粒细胞（2.42%）、单核细胞（28.22%）、巨噬细胞（4.23%）、传统树突状细胞（0.63%）、浆细胞样树突状细胞（0.3%）和巨核细胞（1.74%）。T细胞、NK细胞和B细胞进一步细分为多个亚群。RISR与非ISR组之间各细胞类型比例无显著差异，提示整体免疫细胞组成未发生显著改变。
2. 单核细胞中AP-1的异常激活促进ICA-RISR
对42,731个单核细胞进行亚聚类分析，鉴定出7个单核细胞亚群：S100A+单核细胞（56.4%）、MHC-II+单核细胞（19.1%）、ISG15+单核细胞（9.0%）、TUBB1+单核细胞（4.7%）、ATG+单核细胞（1.8%）、FCGR3A+单核细胞（8.6%）和FCGR3B+单核细胞（0.3%）。RISR患者中MHC-II+单核细胞比例显著降低（P < 0.001），FCGR3A+（CD16+）单核细胞比例显著增加（P = 0.046），经流式细胞术验证（6.97% ± 0.34% vs 1.77% ± 0.33%，P < 0.001）。差异表达分析鉴定出76个上调和40个下调基因，AP-1转录因子复合物核心亚基（JUN、JUNB、JUND、FOS、FOSB）上调最为显著。SCENIC分析证实RISR单核细胞中AP-1表达水平和转录活性均显著增强，且AP-1可能直接调控CXCL8、IL1B、CCL3等促炎细胞因子基因。所有7个单核细胞亚群中AP-1各核心亚基均显著上调，提示AP-1异常激活是RISR冠状动脉单核细胞的核心转录特征。
3. 阐明驱动AP-1激活的上游调控机制
基因集富集分析（GSEA）显示MAPK信号通路在RISR单核细胞中显著富集（归一化富集分数=1.80）。流式细胞术和Western blot证实RISR单核细胞中选择性上调磷酸化p38 MAPK（p-p38 Thr180/Tyr182），而细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）/c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）激活无一致变化。MAPK激活剂（茴香霉素）处理人单核细胞可显著诱导AP-1亚基的基因和蛋白表达，证实p38 MAPK是AP-1的上游调控因子。细胞通讯分析显示CCL信号通路是RISR组单核细胞接收的主要传入信号，CCL5的受体CCR1在RISR单核细胞表面高特异性表达。功能实验证实CCL5刺激可激活p38磷酸化、上调AP-1表达并促进下游炎症因子（CXCL8、IL1B、CCL3）分泌，而CCR1拮抗剂BX471预处理可完全消除这些效应。由此确立了CCL5通过CCR1受体触发p38 MAPK-AP-1炎症级联反应的核心机制。
4. 独立临床队列中关键分子发现的验证
在独立验证队列（8例RISR和8例非ISR）中，流式细胞术证实RISR组FOS和JUN高表达的单核细胞比例显著升高；qPCR和Western blot证实RISR单核细胞中AP-1表达增加，MAPK14（p38 MAPK）和CCR1水平显著升高；AP-1相关炎症因子（CXCL8/IL1B/CCL3）的mRNA表达显著上调；ELISA进一步证实RISR患者冠状动脉血浆中CXCL8和CCL3释放增加。这些结果再次证实了RISR患者单核细胞中CCR1/p38 MAPK/AP-1轴的上调及其促炎细胞因子释放的最终效应。
5. AP-1激活的单核细胞促进VSMC功能改变
将RISR或非ISR患者来源的单核细胞与人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMCs）共培养，EdU染色显示与RISR单核细胞共培养的HCASMCs增殖活性显著增强；Transwell实验和划痕愈合实验显示其迁移能力显著增加。用CCL5预处理单核细胞（模拟AP-1激活）可显著促进VSMC增殖和迁移，而AP-1抑制剂T-5224可完全逆转CCL5诱导的VSMC增殖和迁移能力增强。这些结果表明RISR患者单核细胞通过AP-1依赖性炎症信号机制促进VSMC功能改变，最终导致病理性血管重塑和再狭窄。
6. 单核细胞特异性Fos敲低减轻小鼠血管损伤模型中的新生内膜增生
在小鼠颈动脉导丝损伤模型中，通过AAV载体实现单核细胞特异性Fos基因条件敲低。qPCR证实Fos-AAV组循环单核细胞中Fos表达显著降低。损伤后28天组织学分析显示，Fos-AAV组新生内膜面积显著减少（2.23 ± 0.67 vs 4.03 ± 1.01 × 10? μm2，P < 0.001），管腔狭窄率降低（0.24 ± 0.07 vs 0.43 ± 0.17），内膜/中膜厚度比降低（1.26 ± 0.27 vs 2.83 ± 0.35，P < 0.001）。免疫荧光染色显示，导丝损伤导致Con-AAV组α-SMA表达降低和OPN表达升高（合成表型VSMC标志物），而单核细胞特异性Fos敲低完全消除了这些效应。这些体内结果提供了单核细胞来源的AP-1信号驱动损伤后病理性血管重塑的因果证据。
五、讨论与结论
讨论部分指出，传统上ISR主要归因于机械性因素和晚期新生动脉粥样硬化，但这些机制无法充分解释ICA-RISR的独特特征。本研究通过严格的临床标准支持ICA-RISR是一种局限性的免疫介导性血管病变。单细胞RNA测序显示整体免疫细胞组成无显著差异，但单核细胞表现出高度特异的炎症激活特征，包括MHC-II+单核细胞减少和FCGR3A+单核细胞相对扩增，反映了慢性激活诱导的功能重编程。AP-1作为中央调控枢纽，其异常激活驱动了多种下游炎症介质的上调。上游机制方面，CCR1的选择性上调使单核细胞对局部微环境中的CCL5异常敏感，激活p38 MAPK而非ERK或JNK，进而驱动AP-1表达和激活。这解释了ICA患者尽管全身炎症标志物正常却存在强烈的局部冠状动脉炎症。共培养实验和体内实验共同证实了单核细胞CCR1/p38 MAPK/AP-1/炎症因子轴在新生内膜增生中的因果作用。AP-1抑制剂（如T-5224）已在多种炎症模型中显示治疗潜力，本研究为通过药物涂层球囊或支架平台进行病变导向的AP-1抑制剂递送提供了合理依据。研究团队目前正在建立前瞻性RISR队列并开展随机抗炎试验（NCT06090890）。尚待解决的问题包括ICA-RISR个体易感性的决定因素、有效筛查策略的缺乏、支架植入的慢性机械刺激是否作为ICA发病的触发因素、无永久支架植入策略（如药物涂层球囊或生物可吸收支架）是否可从根源上解决问题，以及能否在支架植入前识别高危个体进行分层干预。
研究结论：本研究首次对RISR进行了系统的免疫学表征，确定单核细胞CCR1/p38 MAPK/AP-1信号轴的异常激活是局限性免疫炎症的核心驱动因素。这些发现将RISR从单纯的机械性并发症重新定义为机制明确的炎症性疾病，为基于免疫的精准治疗开辟了新途径。
