pH响应性Zn2+配位结冷胶/γ-聚谷氨酸水凝胶微球用于骨关节炎关节腔内递送：理化设计、智能释放与软骨保护性能

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：pH-responsive Zn2+-coordinated gellan gum/γ-polyglutamic acid hydrogel microspheres as functional biomaterials for intra-articular delivery: physicochemical design, smart release, and chondroprotective performance in osteoarthritis

引言：骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，其特征为关节软骨基质进行性降解、疼痛相关功能障碍以及缺乏有效的疾病修饰疗法。仙茅苷（Cur）是从Curculigo orchioides中分离的生物活性化合物，具有抗炎和组织保护特性；然而，其直接关节腔内应用受到局部滞留不足和持续作用有限的阻碍。方法：研究人员开发了基于结冷胶（GG）和γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的Zn²⁺配位pH响应性水凝胶微球递送系统（PGG-Zn@Cur），以实现Cur的局部关节腔内递送。在IL-1β刺激的软骨细胞中评估了其细胞相容性和软骨保护作用。进一步进行转录组学分析以探究其治疗作用的潜在分子机制。结果：PGG-Zn@Cur表现出优异的细胞相容性，并恢复IL-1β刺激软骨细胞的软骨基质代谢稳态，表现为COL2A1和ACAN表达增加以及MMP13、ADAMTS5和iNOS水平降低。转录组学分析提示PI3K-AKT信号传导和凋亡相关通路参与PGG-Zn@Cur介导的软骨保护作用。机制上，PGG-Zn@Cur抑制PI3K-AKT通路过度激活，下调Cleaved Caspase-3和Bax表达，减轻软骨细胞凋亡，并缓解软骨退变。讨论：这些发现确立PGG-Zn@Cur作为一种微环境响应性关节腔内平台，可维持软骨基质稳态并减轻PI3K-AKT相关凋亡相关反应，为疾病修饰性OA治疗提供了有前景的策略。

骨关节炎（OA）是一种广泛存在的退行性关节疾病，可导致持续疼痛、活动受限，并已成为累及关节软骨、滑膜、软骨下骨、半月板、髌下脂肪垫及疼痛相关神经免疫反应的全关节疾病。OA进展中，炎症介质和机械应力破坏软骨细胞稳态，造成细胞外基质（ECM）降解、II型胶原和聚集蛋白聚糖丢失、MMP13和ADAMTS5等分解代谢酶上调以及软骨结构进行性退化。当前治疗如非甾体抗炎药、关节腔内皮质类固醇注射、透明质酸补充和晚期关节置换主要控制症状，而非阻止软骨退化或重建ECM稳态。因此，开发能在关节腔内维持软骨细胞功能、减少炎症-分解代谢损伤并实现持续作用的局部治疗策略，是OA干预的重要挑战。仙茅苷（Cur）是从Curculigo orchioides中分离的天然酚类糖苷，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和组织保护作用，可调节NF-κB、JAK/STAT、Nrf2及凋亡相关级联，但其水溶性差、体内清除快、生物利用度低、局部滞留有限和组织靶向积累不足，尤其关节腔内递送时过早清除和不受控药物暴露会显著影响疗效。因此，需要合理设计局部递送平台以延长Cur关节腔内驻留并实现持续、微环境适应性释放。水凝胶因高含水量、组织样理化性质、可注射性和局部持续释放能力，是关节腔内药物递送平台；水凝胶微球具有高比表面积、增强载药和交换、微创可注射、模块化设计及深部组织穿透等优势。GG为阴离子微生物多糖，具有生物相容性、可降解性、离子响应凝胶化和可调力学性能，可模拟软骨ECM某些特征。γ-PGA具有丰富游离羧基，提供高密度配位位点和负电水合微环境。本设计中，GG作为微球形成框架，γ-PGA富集羧酸盐配位位点并提供软骨模拟阴离子水合网络；加入ZnSO₄后，Zn²⁺与GG和γ-PGA链羧酸基团配位形成可逆动态配位网络，生成PGG-Zn水凝胶微球。OA代谢重塑和糖酵解增强导致乳酸积累，乳酸含羟基和羧基，可与金属离子配位，升高的乳酸可能竞争性作用于Zn²⁺，削弱Zn²⁺-羧酸盐交联点，松散微球网络并促进药物释放；OA相关pH波动触发病灶部位按需释放Cur。研究人员开发了负载Cur的PGG-Zn水凝胶微球（PGG-Zn@Cur），通过Zn²⁺介导动态配位用于局部OA干预。微球表现出良好形态、均匀元素分布、配位相关化学特征、高效Cur包封、逐渐降解及pH响应溶胀和释放行为。体外，PGG-Zn@Cur细胞相容性良好，可恢复IL-1β刺激软骨细胞的软骨基质代谢稳态。转录组分析及后续验证发现PI3K-AKT信号和凋亡相关反应是PGG-Zn@Cur介导软骨保护的候选机制。体内，关节腔注射PGG-Zn@Cur改善步态对称性、减轻机械痛敏、保留蛋白聚糖丰富软骨基质、降低组织学退变评分，并减轻OA小鼠PI3K-AKT磷酸化和凋亡相关软骨损伤。这些发现提示PGG-Zn@Cur可作为微环境响应性局部递送平台用于OA干预。

关键技术方法概括：研究人员采用Zn²⁺-羧酸盐动态配位交联制备PGG-Zn@Cur微球，并进行理化表征，包括光学显微镜、SEM、EDS、FTIR、DLS、UV-Vis、Zeta电位、降解、溶胀和释放评价。以IL-1β刺激的原代小鼠软骨细胞（MPCs，来源于2周龄C57BL/6小鼠）建立OA样细胞模型，进行Live/Dead、CCK-8、qPCR、Western blot、IF及RNA测序。动物实验采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠行DMM模型，关节腔内注射，行CatWalk步态、Von Frey、开放场行为学，以及Safranin O/Fast Green、OARSI和改良Mankin评分、石蜡切片IF、TUNEL和Western blot等。样本队列来源：原代软骨细胞来自2周龄C57BL/6小鼠；动物为8周龄雄性C57BL/6J小鼠。

研究结果：3.1 PGG-Zn@Cur水凝胶微球的制备与表征：通过动态Zn²⁺-羧酸盐配位交联策略制备微球。光学显微镜显示球形、尺寸分布较均匀和分散性良好；SEM显示球形及粗糙多孔表面；EDS显示C、N、O、Zn均匀分布；FTIR显示羧酸盐不对称伸缩振动ν_as(COO^?)位移，证实Zn²⁺与GG/γ-PGA羧酸基团形成动态配位键；DLS平均直径约20 μm；包封率约70%，载药量约1.5%；PBS 37 ℃下降解，第60天保留约10%初始干重；pH 5.5溶胀比约800%，高于pH 7.4约600%；pH 5.5下20天累积释放约80%，pH 7.4约55%；Zeta电位随pH升高更负，pH 5.5约?19.5 mV，pH 7.4约?25.0 mV，pH 9.5约?28.5 mV。结论为微球形态均匀、载药可量化、可持续降解且具pH响应溶胀和释放，适合靶向OA治疗。3.2 PGG-Zn@Cur的生物相容性：LIVE/DEAD和CCK-8显示各处理组以绿色活细胞为主，仅偶见红色死细胞；定量细胞活力相当；0–96 h CCK-8显示各组光密度逐渐增加，PGG-Zn@Cur不抑制软骨细胞活力，空载体也无明显抑制。结论为PGG-Zn@Cur与软骨细胞具有良好细胞相容性。3.3 PGG-Zn@Cur恢复IL-1β刺激软骨细胞的基质代谢稳态：通过IF、RT-qPCR和Western blot，IL-1β降低COL2A1荧光并增加MMP13；PGG-Zn@Cur较PGG-Zn或Cur单独更好恢复COL2A1并抑制MMP13。RT-qPCR显示IL-1β降低Col2a1、Aggrecan，升高Mmp13、Adamts5，PGG-Zn@Cur部分逆转。Western blot显示IL-1β升高iNOS、MMP13并降低COL2A1、ACAN，PGG-Zn@Cur逆转这些变化。结论为PGG-Zn@Cur减轻炎症反应和分解代谢激活，并保留基质合成标志物。3.4 PGG-Zn@Cur减弱IL-1β刺激软骨细胞PI3K-AKT激活和凋亡相关反应：RNA测序、热图和火山图显示PGG-Zn@Cur改变软骨基质周转、炎症信号、凋亡相关过程和PI3K-AKT通路相关基因表达；GO富集涉及ECM组织、炎症反应调节、细胞死亡或凋亡、激酶相关信号，KEGG突出PI3K-AKT信号。IF和Western blot验证显示PGG-Zn@Cur降低p-PI3K、p-AKT、Cl-Caspase-3并恢复COL2A1；IL-1β增强PI3K、AKT磷酸化，增加Cleaved Caspase-3、Bax并降低BCL2，PGG-Zn@Cur降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT，抑制Cleaved Caspase-3、Bax并部分恢复BCL2。结论为PGG-Zn@Cur保护软骨细胞免受IL-1β诱导的PI3K-AKT信号和下游凋亡级联相关损伤。3.5 PGG-Zn@Cur改善OA小鼠步态并减轻疼痛相关行为功能障碍：DMM模型及关节腔注射后，CatWalk显示DMM组后肢步态紊乱，PGG-Zn@Cur组足迹分布更协调，RH/LH平均强度、站立时间和最大接触面积比值改善；PGG-Zn无效，游离Cur部分有益，PGG-Zn@Cur显著恢复后肢运动稳定性。Von Frey显示DMM降低缩足阈值，PGG-Zn@Cur显著提高阈值，PGG-Zn作用最小，Cur部分改善。开放场显示DMM中央区探索减少，PGG-Zn@Cur增加。结论为PGG-Zn@Cur改善后肢步态对称性、减轻机械痛敏并改善疼痛相关功能表现和探索行为，具有疾病修饰治疗潜力。3.6 PGG-Zn@Cur减轻OA相关软骨退变并保留基质稳态：Safranin O/Fast Green显示Sham组软骨表面光滑、结构保留、Safranin O强染；OA组表面不规则、基质侵蚀和染色减少；Cur部分保留基质，PGG-Zn@Cur更有效维持软骨结构和Safranin O阳性基质。OARSI和改良Mankin评分显示PGG-Zn@Cur显著降低评分。IF显示OA组COL2A1降低、MMP13阳性信号增强，PGG-Zn@Cur较单药更显著恢复COL2A1并抑制MMP13。结论为PGG-Zn@Cur减轻OA相关软骨退变，保留蛋白聚糖丰富基质并维持体内软骨基质代谢稳态。3.7 PGG-Zn@Cur减弱PI3K-AKT通路激活和凋亡相关软骨损伤：IF显示DMM小鼠p-PI3K、p-AKT荧光信号增强且COL2A1降低，PGG-Zn@Cur降低p-PI3K、p-AKT并恢复COL2A1。TUNEL显示DMM组TUNEL阳性细胞增加，PGG-Zn@Cur显著减少，游离Cur仅呈部分下降趋势。结论为PGG-Zn@Cur减弱OA相关PI3K-AKT磷酸化信号，保留COL2A1表达并减轻凋亡相关软骨细胞损伤。

讨论部分总结：OA以进行性软骨基质降解、疼痛相关功能障碍和有限疾病修饰疗法为特征。关节腔内给药提供直接局部干预途径，但药物从关节腔快速清除和对病理微环境响应不足仍是持久疗效的主要障碍。本研究开发的Zn²⁺配位PGG水凝胶微球递送Cur，微球形态良好、Cur负载有效、逐渐降解且具pH响应溶胀和释放。功能上，PGG-Zn@Cur细胞相容性良好，恢复IL-1β刺激软骨细胞的软骨基质代谢稳态，减弱PI3K-AKT激活和凋亡相关反应；体内改善步态对称性、机械痛敏、软骨退变和凋亡相关软骨损伤，提示其可作为OA局部微环境响应性递送策略。讨论指出，PGG水凝胶不仅是被动药物储库，GG生物相容且离子响应凝胶化，可形成水合网络并部分模拟软骨ECM；γ-PGA富集羧酸盐密度，形成负电、高水合微环境，模拟聚集蛋白聚糖丰富软骨基质的阴离子性质，可能支持软骨细胞表型和ECM稳态。pH响应性行为为适应OA相关病理微环境提供材料基础：OA进展中炎症激活和代谢重塑可改变关节微环境，包括局部酸化和酸性代谢物积累；在生理条件下相对稳定、在酸性炎症微环境中溶胀并释放药物的系统，可能减少提前泄漏并促进病灶释放。讨论还提及，除酸性微环境外，OA驱动活性氧（ROS）和辅酶A（CoA-SH）积累并加速软骨退化，未来将基于新治疗靶点设计更精确递送系统。Cur具有抗炎、抗氧化和组织保护活性，但直接应用受溶解性、清除、关节腔内滞留不足和不受控暴露限制，封装于PGG-Zn微球可提高局部可用性并实现持续释放。PGG-Zn微球也适用于局部基因修饰治疗，阴离子微生物多糖PGG具有良好生物相容性和低免疫原性，pH响应降解可实现炎症OA关节微环境中的靶向释放，未来将验证基因递送能力并探索药物-基因联合策略。软骨细胞存活和基质稳态对维持关节软骨完整性至关重要；PI3K-AKT信号连接炎症应激、凋亡相关损伤和软骨基质重塑，AKT可磷酸化IKK复合物激活NF-κB并放大炎症-分解代谢反应。本研究中PGG-Zn@Cur减弱IL-1β诱导的PI3K-AKT激活和凋亡相关损伤，但PI3K-AKT与IKK/NF-κB模块的精确互作仍需进一步研究。局限性包括：未直接测量OA进展中关节内pH和乳酸水平动态变化；软骨素硫酸盐内源存在于软骨，其硫酸和羧基可能干扰Zn²⁺并影响Cur释放，需进一步实验排除；本研究主要聚焦软骨细胞和关节软骨，而OA是全关节疾病，未来应评估PGG-Zn@Cur对更广泛关节微环境和疾病进展的影响。

研究结论翻译：总之，研究人员通过Zn²⁺介导的动态配位交联构建了负载Cur的PGG-Zn水凝胶微球（PGG-Zn@Cur），用于局部OA干预。研究结果表明，PGG-Zn@Cur具有优异细胞相容性，并恢复IL-1β刺激软骨细胞中软骨基质代谢稳态。体内重复关节腔内给予PGG-Zn@Cur改善疼痛相关功能结局并减轻DMM诱导的软骨退变。机制上，PGG-Zn@Cur通过PI3K-AKT信号和下游凋亡级联维持软骨基质完整性，提示该微环境响应性递送系统作为骨关节炎局部治疗策略具有相当大的潜力。