《Frontiers in Pharmacology》：Zhuyu pill relieves cholestasis in rats by modulating the expression of lncRNAs and circRNAs
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背景： 茱萸丸（ZYP）是一种由黄连（Coptis chinensis Franch）和吴茱萸（Tetradium ruticarpum（A. Jussieu）T. G. Hartley）组成的中药复方，具有潜在的抗胆汁淤积作用。然而，其具体机制尚不清楚。长链
背景： 茱萸丸（ZYP）是一种由黄连（Coptis chinensis Franch）和吴茱萸（Tetradium ruticarpum（A. Jussieu）T. G. Hartley）组成的中药复方，具有潜在的抗胆汁淤积作用。然而，其具体机制尚不清楚。长链非编码RNA（lncRNAs）和环状RNA（circRNAs）是关键的基因表达调控因子，也是探索该机制的有前景的方向。
目的： 本研究旨在验证ZYP的抗胆汁淤积作用，并通过lncRNAs和circRNAs探讨其潜在的生物学机制。
材料与方法： 研究人员采用α-萘异硫氰酸酯（ANIT）诱导的胆汁淤积大鼠模型，给予低剂量（0.6 g/kg）或高剂量（1.2 g/kg）ZYP治疗。通过血清生化学和组织病理学评估疗效。利用RNA测序鉴定肝组织中差异表达的lncRNAs（DElncRNAs）和circRNAs（DEcircRNAs），随后进行GO和KEGG富集分析。使用MiRanda预测DElncRNAs/DEcircRNAs-miRNA相互作用并构建互作网络。随后，通过趋势分析筛选与竞争性内源RNA（ceRNA）调控机制表达模式一致的lncRNA/circRNA-miRNA配对。
结果： 高、低剂量ZYP均显著改善生化学和组织病理学参数，其中高剂量组效果更优。富集分析显示，DElncRNA相关功能主要集中在脂质代谢通路（“胆汁分泌”、“脂肪细胞因子信号通路”、“花生四烯酸代谢”）和炎症相关通路（“NF-κB”、“TNF”、“MAPK”和“炎症性肠病（IBD）”），提示其在减轻炎症损伤和脂质代谢紊乱中的作用。其中，被ANIT改变并被ZYP逆转的核心lncRNAs包括TCONS_00032614、TCONS_00018259、TCONS_00025702、TCONS_00012591和TCONS_00003751，qRT-PCR结果与测序数据基本一致。进一步的lncRNA-miRNA结合预测和表达趋势分析确定了具有潜在ceRNA特征的候选配对：TCONS_00003751/rno-miR-328b-3p、TCONS_00003751/rno-miR-328a-3p和TCONS_00032614/rno-miR-149-5p。同样，DEcircRNA相关通路富集于炎症和免疫反应（“细胞粘附分子（CAMs）”、“抗原加工和呈递”和“细胞色素P450对外源物质的代谢”）。候选circRNAs包括circRNA_1402和circRNA_1452，具有潜在ceRNA特征的候选配对包括circRNA_1402/rno-miR-1306-5p和circRNA_1452/rno-miR-23a-5p。
结论： ZYP以剂量依赖方式改善胆汁淤积大鼠的生化学和组织病理学参数。该作用与lncRNAs和circRNAs调控脂质代谢和炎症相关通路密切相关。初步筛选出若干候选ceRNA配对，但仍有待进一步的实验验证。
论文解读：茱萸丸通过调控lncRNA与circRNA表达缓解胆汁淤积的机制研究
一、研究背景与科学问题
胆汁淤积是一种以胆汁酸（BAs）在肝脏和循环系统中蓄积为特征的急性或慢性病理状态，主要由胆汁生成、分泌和排泄障碍所致，其临床表现为瘙痒、乏力、黄疸和尿色加深等。胆汁淤积的病理机制涉及胆汁酸代谢失衡、胆道梗阻、炎症反应和氧化应激等多个层面，且肠道菌群紊乱可通过肠肝轴影响胆汁酸代谢。根据发生部位，胆汁淤积可分为肝内型和肝外型，其相关肝脏疾病统称为胆汁淤积性肝病（CLD），其中原发性胆汁性胆管炎（PBC）和原发性硬化性胆管炎（PSC）为主要类型。目前胆汁淤积的发病率持续上升，CLD若不加干预，可能进展为肝纤维化乃至肝硬化，并显著增加肝细胞癌等肝胆恶性肿瘤的发病风险。然而，临床治疗选择极为有限，熊去氧胆酸（UDCA）是唯一临床推荐用于PBC的一线药物，但存在大量无应答人群；除肝移植外，PSC目前尚无有效治疗手段。因此，临床迫切需要开发潜在有效的药物和新的治疗方案。
中药复方具有疗效稳定、不良反应少、多靶点协同作用的特点。根据中医理论，胆汁淤积的核心病机为肝胆湿热内蕴，导致肝胆气机郁滞。茱萸丸（ZYP）出自《太平圣惠方》，由黄连和吴茱萸按1:1比例组成，具有清利湿热、疏肝利胆之功，针对胆汁淤积的发病机制。既往研究已证实ZYP对胆汁淤积和溃疡性结肠炎的治疗作用，并从粪便微生物稳态和肝脏mRNA及miRNA表达层面初步阐释了其机制。然而，从lncRNAs和circRNAs角度阐明ZYP治疗胆汁淤积的具体机制尚属空白。LncRNAs是长度超过200个核苷酸的非编码RNA，可通过“分子海绵”吸附miRNA、与蛋白质互作、表观遗传修饰等多种机制调控基因表达；circRNAs是一类通过反向剪接形成的环状非编码RNA，具有更长的半衰期和更强的RNase R抗性，作为诊断生物标志物和治疗靶点更具优势。已有研究表明lncRNAs和circRNAs的异常表达与多种肝脏疾病的发生、进展、诊断和治疗显著相关，因此它们是探索ZYP治疗胆汁淤积机制不可忽视的潜在靶点。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员采用α-萘异硫氰酸酯（ANIT）诱导的大鼠胆汁淤积模型，将30只健康雄性大鼠随机分为对照组、模型组、ZYP低剂量组（0.6 g/kg）、ZYP高剂量组（1.2 g/kg）和UDCA组（60 mg/kg）。通过血清生化学检测和肝组织苏木精-伊红（H&E）染色评估药效。利用RNA测序（RNA-seq）鉴定差异表达的lncRNAs和circRNAs，通过GO和KEGG富集分析解析其生物学功能，采用miRanda预测lncRNA/circRNA与miRNA的结合互作并构建网络，结合表达趋势分析筛选符合竞争性内源RNA（ceRNA）调控机制的候选配对，最后通过qRT-PCR验证关键lncRNAs的表达。
三、研究结果
3.1 ZYP对肝功能与病理的影响
血清生化分析显示，胆汁淤积模型大鼠的肝损伤标志物（ALT、AST、ALP、γ-GT）和代谢紊乱指标（DBIL、TBIL、TBA、TC、TG）显著升高，而ZYP低、高剂量治疗均显著改善这些异常，且高剂量组效果优于低剂量组，呈剂量依赖性。组织病理学检查显示，模型组出现灶性坏死伴炎症浸润，ZYP治疗显著减轻炎症并恢复组织架构，高剂量组组织学表现更接近正常状态，其疗效与UDCA相当。
3.2 差异表达lncRNAs的筛选与定量统计
通过四种预测工具共鉴定出3332个lncRNAs。主成分分析（PCA）显示模型组与对照组显著分离，ZYP干预后整体表达谱向对照组方向回归，且高剂量组更接近对照组。与对照组相比，ANIT诱导导致852个lncRNAs显著差异表达（422个上调，430个下调）；与模型组相比，ZYP-L和ZYP-H分别导致169个和146个lncRNAs差异表达。热图分析表明ZYP对lncRNA表达发挥双向调节作用。
3.3 ZYP调控的DElncRNAs富集分析
GO分析显示，ZYP-H调控的lncRNAs显著富集于免疫炎症调控、糖脂代谢、应激反应和物质转运等生物学过程。KEGG通路分析揭示其富集于脂质代谢通路（“胆汁分泌”、“脂肪细胞因子信号通路”、“花生四烯酸代谢”）和炎症相关通路（“NF-κB信号通路”、“TNF信号通路”、“MAPK信号通路”、“炎症性肠病（IBD）”），这些通路均与胆汁淤积的病理机制密切相关，成为研究的核心通路。
3.4 ZYP治疗胆汁淤积的调控机制
通过整合七条关键信号通路的lncRNA调控图谱，研究人员构建了机制网络图，鉴定出TCONS_00032614、TCONS_00025702、TCONS_00003751、TCONS_00018259和TCONS_00012591为关键候选治疗靶点。
3.5 关键lncRNAs的qRT-PCR验证
除TCONS_00018259外，其余四个lncRNAs的表达趋势与RNA-seq数据一致，验证了测序结果的可靠性。TCONS_00018259的差异归因于两种检测平台的技术差异。基于验证结果，TCONS_00018259被排除出核心lncRNA集合。
3.6 lncRNA-miRNA互作预测与网络构建
生物信息学预测发现TCONS_00003751与rno-miR-328b-3p、rno-miR-328a-3p和rno-miR-6332存在高亲和力结合位点，TCONS_00032614与rno-miR-339-5p和rno-miR-149-5p存在结合位点。网络分析鉴定出10个lncRNAs和16个miRNAs为共同分子枢纽。
3.7 符合ceRNA机制的候选lncRNA-miRNA配对筛选
排除未检测到表达的rno-miR-6332后，表达趋势分析显示TCONS_00003751/rno-miR-328b-3p、TCONS_00003751/rno-miR-328a-3p和TCONS_00032614/rno-miR-149-5p三对组合在建模和治疗两个节点均呈现完全相反的动态变化，符合ceRNA调控机制特征。
3.8 差异表达circRNAs的筛选与定量统计
共鉴定出2025个已知circRNAs。PCA显示模型组与对照组显著分离，ZYP治疗后表达谱部分逆转。ANIT导致36个circRNAs显著差异表达（19个上调，17个下调），ZYP-L和ZYP-H分别改变18个和14个circRNAs。热图分析证实ZYP对circRNAs发挥双向调节作用。
3.9 差异表达circRNAs的功能分析
GO和KEGG富集分析显示，ZYP-H上调的circRNAs主要富集于细胞色素P450介导的药物和外源物质代谢通路，下调的circRNAs主要富集于免疫相关通路，包括细胞粘附分子（CAMs）通路和抗原加工与呈递通路。circRNA_1402和circRNA_1452被鉴定为关键调控因子。
3.10 circRNA-miRNA互作预测与网络构建
预测分析显示circRNA_1402与12个miRNAs、circRNA_1452与6个miRNAs存在高亲和力结合位点。网络分析鉴定出2个circRNAs和44个miRNAs为共同分子枢纽。
3.11 符合ceRNA机制的候选circRNA-miRNA配对筛选
排除未检测到表达的miRNAs后，表达趋势分析显示circRNA_1402/rno-miR-1306-5p和circRNA_1452/rno-miR-23a-5p两对组合符合ceRNA机制的表达特征。
四、讨论与结论
讨论部分围绕lncRNA和circRNA的潜在机制展开。在lncRNA方面，脂质代谢相关通路中，ZYP可能通过调控TCONS_00012591、TCONS_00018259和TCONS_00003751实现三重治疗效应：重新平衡脂肪细胞因子分泌、增强有益花生四烯酸代谢产物、直接调节胆汁分泌。在炎症相关通路中，ZYP通过调节关键lncRNAs实现NF-κB、MAPK和TNF信号通路的整合调控，抑制过度炎症反应并减轻凋亡损伤。在候选ceRNA配对方面，上调的TCONS_00003751可能作为分子海绵吸附miR-328a-3p和miR-328b-3p，参与调节肝胆结构损伤与重塑；下调的TCONS_00032614可能减少对miR-149-5p的吸附，增强该miRNA的抗炎和抗应激保护作用。在circRNA方面，ZYP可能通过上调circRNA_1402增强细胞色素P450介导的毒性外源物质代谢清除，通过下调circRNA_1452抑制免疫介导的损伤。候选配对circRNA_1402/rno-miR-1306-5p和circRNA_1452/rno-miR-23a-5p可能分别通过吸附抑制促凋亡和促纤维化的miR-1306-5p、增强具有抗炎作用的miR-23a-5p来发挥保护效应。
研究结论为：ZYP以剂量依赖方式显著缓解胆汁淤积，该治疗作用可能与调控参与脂质代谢和炎症通路的lncRNAs和circRNAs有关。通过结合靶点结合预测和双向表达趋势约束的多维交叉验证，初步筛选出若干候选ceRNA调控轴，这些轴代表了ZYP保护作用背后可验证的机制假说，但仍需进一步功能实验验证其具体作用。该研究为中药治疗胆汁淤积提供了初步机制见解，为后续深入机制研究奠定了基础。
