《JID Innovations》：A simple and minimally-invasive device for skin sampling and molecular detection in cutaneous fungal infections
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皮肤真菌感染构成全球重大疾病负担，并因频繁复发而难以治疗。迄今为止，真菌检测的分子方法已取得显著进展；然而，对通过皮肤刮取进行样本采集的标准临床实践关注甚少，该过程依赖操作者与技能，且仅限于表面。在本研究中，研究人员评估了先前报道的采样工具——微针阵列（MPA
皮肤真菌感染构成全球重大疾病负担，并因频繁复发而难以治疗。迄今为止，真菌检测的分子方法已取得显著进展；然而，对通过皮肤刮取进行样本采集的标准临床实践关注甚少，该过程依赖操作者与技能，且仅限于表面。在本研究中，研究人员评估了先前报道的采样工具——微针阵列（MPA）作为微创采样方法用于疑似皮肤感染患者真菌分子检测的临床效用。使用刮取法采集的皮肤样本进行了类似处理以作比较。使用泛真菌定量PCR（qPCR）检测能够区分感染毛癣菌（Trichophyton）和念珠菌（Candida）的样本，而宏基因组测序分析提供了更详细的种水平鉴定——尤其对白色念珠菌（Candida albicans）——并显示出比显微镜检查和培养更高的敏感性。在临床阳性样本中，两种采样方法显示出可比的相对丰度谱。然而，研究人员观察到两种采样方法在某些物种检测上存在差异，这提示这些真菌的空间分布可能存在差异。总体而言，这些发现证明了将基于MPA的经表皮采样与已建立的分子检测方法相结合以促进临床真菌诊断的可行性。
皮肤真菌感染（cutaneous fungal infections，如 tineas、candidiasis）构成全球重大疾病负担。真菌感染上升趋势以及全球抗真菌耐药加速，预计会增加医疗成本并造成显著疾病负担，尤其当诊断延迟时。皮肤真菌感染症状包括红色变色病变、瘙痒、鳞屑或脱屑、皮疹、水疱和肿胀。皮肤癣菌（dermatophyte）如毛癣菌（Trichophyton）是 tinea 最常见的致病病原，而皮肤共栖和机会致病菌马拉色菌（Malassezia）过度生长也可引起花斑癣（pityriasis versicolor）、脂溢性皮炎（seborrheic dermatitis）或毛囊炎（folliculitis）。耐药物种如 Candida auris 和 Trichophyton indotiniae 的出现，使准确检测和诊断变得关键。然而，常规采样方法如皮肤拭子（skin swabs）、胶带条（tape strips）和刮取（scrapings）存在明显局限。皮肤拭子和胶带条主要采集皮肤表面物质，需要重复应用以评估更深皮肤层。皮肤刮取（skin scraping/scrape）是真菌感染采样和检测最常见的标准临床实践，包括通过皮肤刮取采集样本，随后进行直接显微镜检查和/或真菌培养。虽然皮肤刮取物的显微镜检查可快速提供真菌的视觉识别，但其敏感性高度依赖捕获足够的生物量，且不能进行准确的真菌种鉴定。培养可提供物种信息，但敏感性相对较低且周转时间长（约6-8周）。刮取病变以采集皮肤标本可能使患者不适，并且技术上要求高、因受训操作者而异，进而对下游验证产生显著影响。因此，临床需要一种简单且敏感的皮肤真菌病原采样和鉴定方法，以便患者获得及时治疗并减少因复发感染而进行的随访门诊次数。Liang et al. 先前开发了一种微创、经表皮皮肤微生物组采样装置，即微针阵列（microprojection array, MPA）贴片，并通过增材制造实现系统优化。该装置在健康人类志愿者头皮采样中验证了所采集微生物分子检测的可行性，并观察到基于MPA的采样在真菌采集多样性和丰度上优于拭子和胶带条。与仅从皮肤表面采样的拭子和刮取不同，MPA能够采样表面并到达更深表皮层。既往研究评估了MPA在健康个体微生物组分析中的应用，而本研究评估其在临床背景中的效用，特别是用于疑似皮肤感染患者真菌分子检测和鉴定的标本采集。研究人员将基于MPA采样的性能和可行性与常规皮肤刮取进行比较，同时将分子检测结果与常规临床显微镜检查和培养进行参照评估。总体结论是，基于MPA的经表皮采样与qPCR和NGS结合具有可行性，qPCR可区分毛癣菌和念珠菌感染样本，NGS可实现更精细种鉴定，尤其对白色念珠菌，并较显微镜或培养更敏感；两种采样方法在临床阳性样本中相对丰度谱相似，但某些物种差异提示皮肤内空间分布差异；该策略支持MPA作为现有采样方法的潜在辅助工具，用于分子真菌检测。
为开展研究，研究人员采用单中心、前瞻性队列研究，样本采集自新加坡国家皮肤中心（National Skin Centre, NSC）的149名受试者。受试者为21岁及以上、临床怀疑真菌感染且在采样前两周内未使用口服或外用抗真菌药的患者。每位患者多个部位，共268个采样点；配对两种采样方法共536份皮肤标本。皮肤刮取由专业临床技师操作；MPA为3D打印生物相容树脂制成的22×10 mm贴片，含4×10枚微针，每枚高1.2 mm，按压10 s，每部位3次。样本分别用于标准显微镜检查和培养，以及分子检测。分子方法包括基于ITS保守区设计的泛真菌qPCR，以及NGS的ITS扩增子测序；序列经DADA2/QIIME2等分析获得扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASV）。
在研究结果中，“泛真菌qPCR定量所采样物种的比较”部分显示，研究人员首先基于皮肤刮取标本的标准显微镜检查和培养建立临床诊断。共从149名疑似真菌感染患者多个部位采集268份样本，足部是最常见感染部位（26.8%）。约30.6%的采样部位经显微镜和培养验证为真菌感染。67份（25%）样本显微镜阳性，42份（15.7%）培养阳性，186份（69.4%）显微镜和培养均阴性。在149名受试者中，通过显微镜和培养组合获得34.9%的阳性物种鉴定。MPA为矩形贴片（22×10 mm），由4×10枚微针组成，每枚高1.2 mm。与通过重复力剥离微生物标本的刮取不同，MPA通过粘附贴片表面回收微生物。由于MPA并非为显微镜和培养鉴定设计，研究人员用qPCR和下一代测序（next generation sequencing, NGS）比较MPA和皮肤刮取两种采样方法。为定量和比较采集的真菌负荷，研究人员基于ITS1和ITS2保守区设计泛真菌引物，该引物对临床相关真菌物种具有广谱特异性，并显示对真菌优于细菌和人gDNA的特异性。对所有MPA和刮取样本进行泛真菌qPCR。未观察到临床阳性（经显微镜和培养确认）与阴性样本的CT值有明显分离。MPA采样所得CT值直方图呈单峰分布，显微镜和培养阳性样本CT值较低；相反，刮取采样所得CT值呈多峰分布，样本标准差范围更大。刮取采集样本中显微镜和培养阳性样本的CT范围低于MPA对应样本。研究人员观察到MPA采样中显微镜阳性与双阴性样本CT值有显著差异（p<0.05），而刮取采样中显微镜阳性和培养阳性样本CT值均显著低于双阴性样本（p<0.0001）。总体而言，MPA采样在临床阳性样本中产生较高CT值，提示MPA采集标本的真菌负荷低于刮取，且对泛真菌qPCR检测敏感性较低。按菌丝阳性（皮肤癣菌）和假菌丝阳性（念珠菌）分层后，皮肤刮取和MPA均显示CT值显著低于双阴性样本；酵母阳性（马拉色菌）样本CT值未显著低于双阴性对照。
“NGS鉴定所采样物种的比较”部分显示，研究人员进一步进行NGS真菌物种鉴定。在采集的536份皮肤标本中，120份由配对和非配对的MPA与刮取样本混合组成，在成功文库制备后经NGS测序和分析。并非所有样本均纳入NGS分析，原因是满足质量和产量要求存在技术挑战。研究人员注意到，念珠菌阳性皮肤样本在文库制备中最成功，可能因这些样本负荷较高，正如qPCR结果所示。MPA和刮取在所有样本中的文库制备成功率相当。在所有患者样本中，最丰富的5个真菌属为 Malassezia、Trichophyton、Aspergillus、Candida 和 Ramularia。这与既往报道一致，即当地最常见浅表真菌感染为 tineas、pityriasis 和 candidiasis，分别可归因于 Trichophyton、Malassezia 和 Candida。进一步分析所有样本中5个最常见属的相对丰度发现，在临床阳性样本中，同一皮肤标本用MPA或刮取采集所得真菌属谱高度相似。当 Candida 和 Malassezia 为优势种时，一致性高于 Trichophyton 主导样本。为比较两种采样方法的测序结果与临床检查在种水平上的一致性，研究人员量化了NGS获得的ASV计数。对于经临床鉴定感染物种且用两种采样方法采集的样本，观察到 Candida albicans 计数显著升高，表明NGS与培养结果高度一致。研究人员注意到，对于 Trichophyton rubrum 以及 Malassezia 物种如 M. globosa、M. restricta 和 Malassezia spp.，MPA采集样本与临床结局的一致性低于刮取。NGS分析还显示，某些MPA采集标本中几种 Aspergillus 更丰富，但由于它们不常规培养，无法与临床检查建立一致性。有趣的是，在双阴性样本中，MPA和刮取均鉴定出一些潜在致病物种ASV计数升高，包括 Trichophyton rubrum、M. restricta 和 Aspergillus hordei。这一发现提示NGS可能比显微镜和培养临床检测方法具有更高鉴定敏感性，并可能检测不常规显微镜检查或临床实验室培养的少见致病真菌物种，如 Aspergillus。总体而言，两种采样方法经NGS鉴定的真菌物种与显微镜和培养临床诊断对 Candida albicans 一致性良好；刮取采样在检测 Trichophyton rubrum 以及包括 M. restricta 和 M. globosa 在内的几种 Malassezia 物种时，与显微镜结果一致性更高。最后，由于皮肤刮取和MPA可达深度不同，研究人员研究这如何影响其可采集的真菌物种。为评估两种采样方法采集不同真菌物种的能力，比较了NGS获得的四个最优势真菌属 Trichophyton、Malassezia、Candida 和 Aspergillus 的ASV计数。观察到 Trichophyton 在刮取采集样本中显著更高，而 Aspergillus 在MPA采集样本中显著更高，提示每种方法对某些物种可能具有更优采样效率。种水平进一步检查显示，属水平差异的主要贡献因素是 Trichophyton rubrum 和 Aspergillus hordei，分别在刮取和MPA采集样本中检测水平更高。样本的非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling, NMDS）图显示，双阴性样本用刮取和MPA采集后聚类在一起并有部分重叠，而显微镜或培养阳性样本分布更分散，可能反映采样部位和不同致病物种的多样性。对于另外两个较丰富属 Candida 和 Malassezia，两种采样方法ASV计数无显著差异，表明MPA和刮取对这两种真菌的采样效率相似。
讨论部分总结，研究人员探索了先前报道的采样工具MPA与分子鉴定方法结合用于皮肤真菌感染临床检测的转化效用。理想采样工具应易用、微创，并作为生成准确可靠结果的平台。皮肤刮取是当前标准治疗，因其能够捕获最高生物量；但它需要技术培训，结果高度变异。这种变异可能阻碍充分采集更深表皮层微生物。MPA或微针阵列由三维微米级针阵列组成，旨在克服皮肤屏障，通常被认为微创且无痛，使其成为即时诊断的有吸引力的选择。本研究评估这些既定特性是否可应用于临床环境中的真菌标本采集。MPA采样方法的优势包括应用简便、能够采样更深表皮层以及标准化应用。与通常由皮肤科中心受训技师进行的皮肤刮取相比，MPA还允许在全科医生诊所进行采样检测，并送至诊断实验室进一步处理，这可能显著增加患者覆盖范围。成本是临床转化的另一重要因素。随着较新基因组方法成本持续下降以及人力减少带来的成本节约，基于MPA的采样和分子检测方法预计未来可与依赖人力的刮取-显微镜方法相当。皮肤感染病原真菌采样必须与下游鉴定方法结合用于临床诊断。临床最常用方法是显微镜检查和培养。显微镜快速，但不能提供准确的种水平鉴定，而随着耐药真菌如 T. indotiniae 和 C. auris 出现，种水平鉴定日益关键。培养可用于产生足够真菌生物量以进行物种鉴定和抗真菌药敏试验，但受低敏感性和长周转时间限制。近年来，qPCR和NGS等分子检测方法因速度和敏感性提高而成为有吸引力的替代方案。由于皮肤刮取和MPA均适用于这些下游处理方法，研究人员应用它们比较采样效率。对于qPCR分析，研究人员通过设计和使用泛真菌特异性引物按真菌负荷分层，该引物在细菌和人DNA模拟群落中对真菌DNA显示优越敏感性。在患者样本中，研究人员观察到MPA采集样本总体真菌负荷低于刮取，表现为较高泛真菌qPCR CT值，这可能因MPA样本生物量较低。差异可归因于微生物采集机制。与通过重复研磨作用采集微生物的皮肤刮取相比，MPA通过粘附提取的微生物组受其表面积限制。未来可每部位联合多个MPA进行皮肤标本采集，以增加微生物生物量，从而增强检测敏感性。对于两种采样方法，研究人员观察到怀疑 Trichophyton 和 Candida 感染样本的真菌负荷高度相关。相反，在 Malassezia 病例中未见明显相关性。这提示皮肤癣菌（Trichophyton）和 Candida 相关感染的真菌负荷较 Malassezia 对应感染更高。已知不同真菌株和物种间拷贝数变异可能在比较样本真菌负荷时成为混杂因素。为阐明这些患者真菌负荷是否异常，未来研究按真菌病原物种分层或比较病变与非病变部位将有助于揭示部分混杂因素。然而，必须考虑qPCR真菌负荷定量还可能受其他混杂因素影响，包括样本生物量、身体部位和个体间变异。与qPCR相比，NGS提供了所有皮肤采样真菌物种相对丰度的更全面概览。NGS分析显示，两种采样方法采集的临床阳性样本具有相似相对丰度谱。在种水平，刮取样本中检测到的 Trichophyton 量更高，而MPA样本中 Aspergillus 量更高。这可能由于 Trichophyton 在浅表角质层中高流行，易被表面刮取采集。与 Trichophyton 不同，Aspergillus 在皮肤真菌感染中发生频率低得多，耳部感染除外。缺乏额外临床数据时，研究人员无法确认它们是否导致疾病，或来源于共栖或环境。皮肤 Aspergillus 已有报道可从医院等外部环境获得，尽管其作为皮肤病原体的作用仍知之甚少，需要进一步研究。然而，经表皮采样装置MPA在提取 Aspergillus 方面较浅表皮肤刮取更高效，提示该真菌可能定植于更深皮肤生态位。MPA到达更深皮肤部位的能力还使其可能采样传统上难以检测的痤疮粉刺和毛囊中微生物。当前研究存在一些局限。虽然耐受性和疼痛不是研究方案的一部分，但未来临床研究纳入MPA装置这些评估将很重要，尤其对儿科人群高度相关。其次，研究人员无法在每病变水平观察每ng总DNA中人类/真菌DNA的特定趋势。这可能是由于身体皮肤部位不同以及真菌病原定植的不同皮肤表面生态位等变量。将研究范围缩小到标准化皮肤部位的特定真菌感染物种可解决部分变异性，但会减少可招募队列规模。最后，一些参与者贡献了多个临床受影响病变的样本。尽管这些代表不同病变并允许评估个体内空间异质性，但由于共享宿主水平因素，它们并非完全独立观察。个体内病变采样在 Candida 和 Malassezia 阳性病变个体中也更频繁，因此可能在基于病变比较中引入患者水平聚类。因此，分类群特异性发现应视为探索性，并需在更大队列中使用考虑个体内观察的分析验证。
研究结论翻译：总之，本研究证明了将先前建立的MPA采样工具与qPCR和NGS结合应用于疑似真菌感染临床研究的可行性和临床效用。泛真菌qPCR检测能够区分感染毛癣菌和念珠菌的样本，而NGS能够实现更精细的种鉴定——尤其对白色念珠菌——并显示出比显微镜检查或培养更高的敏感性。两种采样方法在临床阳性样本中产生相似的相对丰度谱，尽管毛癣菌和曲霉等物种差异提示皮肤内空间分布存在变异。总体而言，这些发现支持基于MPA的经表皮采样作为现有采样方法的潜在有用辅助，用于分子真菌检测。仍需进一步研究优化标本回收，并建立其诊断性能和临床工作流程中的实际作用。
