引言
外泌体是细胞分泌的囊泡，直径范围在30到150纳米之间，广泛存在于包括血液、尿液和唾液在内的生物流体中[1,2]。外泌体携带多种生物活性分子，如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质，并参与细胞间物质运输、信号转导和免疫调节等核心生理过程[[3], [4], [5], [6]]。尿液是一种非侵入性的生物流体来源，富含外泌体成分。早期的蛋白质组学研究已经鉴定了尿液中外泌体中的多种蛋白质，并验证了它们作为肾部和泌尿系统疾病诊断生物标志物的潜力[[7], [8], [9], [10]]。
高纯度、高产量的结构完整的外泌体分离是外泌体蛋白质组学、转录组学和临床生物标志物筛选不可或缺的前提[11]。外泌体由具有不同物理化学性质的异质亚群组成，这对分离的分辨率提出了更高的要求[12,13]。目前常用的外泌体分离技术[[14], [15], [16], [17]]主要包括梯度离心[[18], [19], [20], [21]]、聚合物沉淀[[22], [23], [24], [25]]、尺寸排阻色谱[[26], [27], [28]]、超滤[29,30]、亲和捕获[31,32]以及微流控芯片[[33], [34], [35], [36], [37], [38], [39]]。梯度离心仅基于颗粒的密度/大小进行分离，但长时间的高速离心会导致囊泡聚集和膜破裂，其典型回收率约为40-60%[40]。尺寸排阻色谱会将小分子可溶性蛋白质与微小外泌体一起洗脱出来，从而造成严重的蛋白质污染并降低样品的制备效率。亲和捕获方法包括免疫亲和[41,42]和基于材料的亲和富集[43], [44], [45]。Pei等人[46]制备了双功能免疫亲和磁性纳米颗粒（BI-NPs），通过主客体相互作用同时结合Ti??和抗体，高效捕获并富集了细胞培养上清液中的外泌体。亲和纯化可以获得高纯度的外泌体，但只能分离出一种类型的囊泡，无法同时分离多种外泌体亚型。Liu等人[47]使用声流控装置分离小外泌体（sEVs）并通过荧光显微镜实现其实时可视化。
外泌体表面的电荷主要由表面蛋白质的电荷状态决定，并受到翻译后修饰的动态影响。外泌体表面电荷的异质性源于膜成分的不同修饰，这种异质性通过静电相互作用调节了外泌体的胶体稳定性、体内分布和细胞摄取，从而直接影响其生物学功能，包括细胞间通讯、免疫调节和靶向递送[48,49]。不同来源的细胞和细胞周期状态赋予外泌体独特的蛋白质和脂质组成，这种分子水平的异质性产生了特定的等电点（pI）和生物学功能[50]。例如，富含蛋白聚糖的癌细胞来源的外泌体表现出不同的表面电荷特征，这与其器官趋向性转移潜力相关[51]。研究表明，带负电荷的外泌体亚群与特定的膜蛋白表达模式相关，基于电荷的分级可以富集具有不同功能的外泌体亚群[[52], [53], [54]]。这种电荷-功能关系强调了开发基于外泌体内在表面电荷特性的分离方法的重要性，而不仅仅是基于大小或密度。
自由流动电泳（FFE）是一种没有固体支持介质的连续液相电泳技术，不会产生固定相吸附且流体剪切力较小。它可以根据电荷/pI差异实现实时连续分级，适用于蛋白质、细胞器和外泌体等敏感的生物纳米颗粒。最近，FFE被用于从细胞培养上清液和血浆中粗分离外泌体[[55], [56], [57], [58]]。自由流动等电聚焦（FFIEF）在施加电场下产生稳定的线性pH梯度，从而高分辨率地分离具有不同表面pI的外泌体亚型。该方法弥补了传统基于尺寸/密度的分离方法的局限性。Cao的团队开发了往复式FFIEF，可以根据pI差异分离线粒体、唾液微生物群和牛奶中的外泌体[50,59,60]。然而，传统的FFIEF依赖于昂贵的两性分子来构建pH梯度，这些两性分子会与外泌体一起洗脱，干扰荧光标记和后续的质量谱蛋白质组学检测，大大增加了样品预处理的复杂性[61,62]。无载体两性分子的FFIEF解决了这些问题，适用于生物样品的制备和分析工作流程。我们团队之前构建了一个覆盖pH 4-9范围的无载体两性分子FFIEF系统，成功分离了三种主要的卵白蛋白：卵黏蛋白、卵清蛋白和卵转运蛋白[62]。Yoon等人[63]建立了一个无载体两性分子的微尺度FFIEF平台，用于分离聚苯乙烯颗粒、大肠杆菌和mRNA-脂质纳米颗粒。然而，该系统仅适用于微量细胞培养基，限制了无需进一步亚型分级的可扩展性制备。
碳量子点（CQDs）直径小于10纳米，具有良好的生物相容性、稳定的荧光信号、强的抗光漂白能力以及与外泌体磷脂双层的易结合性。它们可以实现对外泌体的非破坏性荧光标记，允许在365纳米紫外光照射下实时观察电泳条带，并快速定位目标组分[[64], [65], [66]]。Ajami等人[67]提出的碳纳米管复合材料的靶向传感方法表明，碳量子点（CQDs）可用于外泌体的荧光可视化和追踪。
在本文中，我们构建了一种无载体两性分子的自由流动等电聚焦（CA-free FFIEF）装置。通过强酸/碱电极缓冲液与载体缓冲液之间的阴离子/阳离子交换膜分离，完全消除了载体两性分子对后续检测的干扰。通过系统优化施加电压、载体缓冲液流速和样品注入流速，我们建立了一种适用于复杂尿液基质中外泌体的连续分级方案。FFIEF成功分离了不同的外泌体亚群，揭示了它们之间的差异，这是传统方法无法实现的。使用蓝色碳点（BC-dots）对外泌体进行荧光标记，有助于实现尿中外泌体的全过程可视化分离和目标组分的快速鉴定。结合TiO2微球制成的MOAC纯化技术进一步去除了共洗脱的杂质蛋白并富集了低浓度的外泌体亚群。
