基于UHPLC-QTOF-ESI/APCI的多柔比星HCl脂质体综合脂质组成分析：磷脂杂质、降解产物、胆固醇氧化产物及仿制药脂质谱可比性

《Journal of Chromatography B》：Comprehensive composition analysis of doxorubicin HCl liposomes

多柔比星HCl脂质体的综合组成分析
•先进方法：UHPLC-QTOF-ESI/APCI（超高效液相色谱-四极杆飞行时间-电喷雾/大气压化学电离）用于全面的脂质体脂质谱分析。
•杂质鉴定：检测到两种磷脂杂质，低于2.4 mol%。
•降解产物：发现六种FFAs（游离脂肪酸）和四种溶血磷脂，处于痕量水平。
•胆固醇氧化：Desmosterol和7-ketocholesterol检测低于0.3 mol%。
•仿制药等效性：所有五种制剂显示可比较的脂质谱。

多柔比星HCl脂质体（doxorubicin HCl liposomes）由DOXIL于1995年获美国食品药品监督管理局（FDA）批准成为首个脂质体衍生产品，其可改变多柔比星药代动力学，增强治疗结局并减少非靶器官分布，降低心脏毒性。随后四种仿制多柔比星HCl脂质体上市。其载体主要由钠;[(2R)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] 2-(2-methoxyethoxycarbonylamino)ethyl phosphate（mPEG₂₀₀₀-DSPE）、全氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）和胆固醇组成。脂质是脂质体制剂主要成分，在加工和储存中易降解和氧化，形成杂质和脂质降解产物；脂质组成变化可能影响脂质体稳定性和药物释放特征，进而影响产品质量和疗效。脂质水解、氧化、融合、药物泄漏和聚集可在制剂制备和储存中发生。因此，研究人员开展多柔比星HCl脂质体的综合探索性组成分析，采用先进分析方法深入了解脂质成分、比例及制造储存中可能形成的降解产物；此前研究人员已用超高效液相色谱（UHPLC）结合四极杆飞行时间质谱（QToF-MS）分析DOXIL主要脂质和胆固醇，本研究扩展检测所有五种当前制剂中既往未鉴定的脂质降解产物、氧化产物和脂质杂质。研究结果显示各制剂脂质谱可比，仅杂质和降解产物有微小差异。该研究为仿制药逆向工程和质量控制提供重要性，支持仿制药与参考产品标准对比，增强监管机构和医疗提供者对仿制药安全性有效性的信心。

主要关键技术方法（不超过250字）：样本队列来源：从WEP Clinical（Morrisville, NC, USA）获得Doxil（Baxter Healthcare Corporation，批号LFZT800）及四种仿制药：Sun Pharmaceutical Industries Ltd.（批号HAD0431A）、Dr. Reddy's Laboratories Ltd.（批号501,887）、Ayanna Pharma Ltd.（批号050122）、Zydus Pharmaceuticals（批号P200135）。研究人员建立反相UHPLC-QTOF-MS方法：PC、LPC、LPE和mPEG₂₀₀₀-DSPE用CSH C18柱和电喷雾电离（ESI）正离子模式；游离脂肪酸（FFA）用BEH C8柱和负离子模式；胆固醇及衍生物用CSH C18柱和大气压化学电离（APCI）正离子模式。用SimLipid、LIPID MAPS和标准品交叉验证，MassHunter定量/半定量，按FDA/ICH验证，并采用内标。

3.1 UHPLC和QTOF-MS方法开发及多柔比星HCl脂质体分析分离：研究人员通过优化流动相、色谱柱、梯度和离子化设置，建立正/负ESI及APCI方法。该部分通过UHPLC-QTOF-MS/MS和数据库检索鉴定主要脂质PC 18:0–18:0、PC 16:0–18:0和mPEG₂₀₀₀-DSPE，并发现两种额外磷脂PC 17:0/18:0、PC 18:0/20:0及溶血磷脂LPC 16:0、LPC 18:0、LPE 16:0、LPE 18:0等。FFA在负模式检测，胆固醇及衍生物在APCI正模式检测。根据洗脱顺序和碎片模式确认结构。结论：所开发方法可分离和检测脂质、降解产物和胆固醇衍生物。

3.2 方法验证
3.2.1 内标：通过加入氘代PC 18:0-d₇₀、PEG₅₅₀-DSPE、LPC 26:0、17:0 LPE-d₅、FFA 18:0-d₃₁和胆固醇-d₇作为内标（IS），保证痕量脂质准确定量。
3.2.2 校准曲线及检测限和定量限：通过八浓度标准曲线和加权线性回归，13种分析物R²>0.99；检测限（LOD）和定量限（LOQ）按公式计算，磷脂、溶血磷脂、胆固醇和胆固醇氧化产物（COP）的LOD 5–20 ng/mL、LOQ 10–60 ng/mL；FFA在负模式LOD 5–20 ng/mL、LOQ 10–60 ng/mL。
3.2.3 精密度和准确度：三天内低中高质控（QC）样品，日内和日间精密度相对标准偏差（RSD）<10%，准确度85–115%，符合国际人用药品注册技术协调会（ICH）要求，表明方法可靠可重复。

3.3 Doxil及其仿制药中脂质辅料定量：对五个厂商制剂，每制剂三样本、每样本三注射，共九次注射；用八点校准曲线完全定量，两种无商业标准磷脂用内标半定量。
3.3.1 磷脂和溶血磷脂定量：通过完全定量，HSPC测得9.57–9.67 mg/mL，mPEG₂₀₀₀-DSPE 3.15–3.22 mg/mL，符合标签；二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）平均约7.29 mg/mL，棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱（PSPC）约2.3 mg/mL。PC 17:0/18:0约0.14–0.15 mg/mL，PC 18:0/20:0约0.15–0.17 mg/mL，合计低于总脂质2.4 mol%。LPC 16:0和LPC 18:0在所有制剂中检出，Vendor 3、4、2略高，Vendor 1、5较低；LPE 16:0缺失或低于LOD；LPE 18:0除Vendor 3外存在；总溶血磷脂（LPL）低于约1.25 mol%总磷脂，Vendor 1和5低于约1.0 mol%。结论：轻微差异可能源于制造工艺，LPC显著升高可能损害稳定性和性能，影响药物递送效率和安全性。
3.3.2 游离脂肪酸定量：通过负离子模式定量，FFA 18:0最丰富，Vendor 3最高0.56 μmol/mL；FFA 16:2仅Vendor 1和5，FFA 18:1仅Vendor 1、2、3；差异可能因制造工艺、处方组成或原料来源；所有FFA低于总磷脂2.5 mol%。
3.3.3 胆固醇氧化产物定量：通过APCI正模式定量，胆固醇浓度符合标签；Desmosterol和7-ketocholesterol被检测，7-ketocholesterol在Vendor 3最高29.92 ng/mL、Vendor 4最低3.96 ng/mL；Desmosterol在Vendor 2最高11.26 ng/mL、Vendor 4最低7.89 ng/mL；二者作为总胆固醇百分比低于0.3 mol%。结论：胆固醇相关化合物存在但总体水平低。

讨论部分总结：研究人员指出，溶血磷脂和FFA可指示制造和储存中脂质水解，水解受温度、pH、水暴露和加工时间影响；因单时间点分析上市制剂，检测到的溶血磷脂不能确定具体制造或储存步骤。胆固醇易氧化形成COP，热和氧暴露促进COP形成；COP具有显著生物效应。尽管观察到轻微变异，五制剂脂质谱可比，杂质符合ICH指南。先进方法对参考产品逆向工程和质量控制重要，尤其对仿制药厂商，可确认辅料来源和仿制药与参考产品标准一致。

研究结论翻译：对多柔比星HCl脂质体制剂通过一系列UHPLC-QTOF-ESI/APCI方法结合SimLipid数据分析进行综合脂质分析，能够鉴定脂质体和胆固醇杂质、降解产物及胆固醇氧化产物（COPs）。该五种多柔比星HCl脂质体制剂的比较研究显示所有产品脂质谱可比，且杂质符合ICH指南。PC(17:0/18:0)和PC(18:0/20:0)被鉴定为所有制剂中痕量存在的脂质杂质，各占总磷脂少于2 mol%。还检测到四种溶血磷脂降解产物，其中LPC 18:0在所有制剂中最丰富；定量上，四种溶血磷脂产物合计少于总磷脂1.25 mol%。胆固醇杂质Desmosterol在所有制剂中痕量存在，唯一检测到的胆固醇氧化产物7-ketocholesterol也处于低水平。所有制剂中检测到游离脂肪酸（FFAs），其中FFA 18:0最丰富。这些先进方法在参考产品逆向工程中具有应用前景，为仿制药制造商理解脂质体制剂组成和确认辅料适当来源提供有效手段。该方法增强对脂质体基制剂均一性和稳定性的信心，有益于产业和公共健康。