使用相同脂质纳米颗粒制剂，mRNA、saRNA和pDNA作为单独或共递送载荷的蛋白表达动力学

《Journal of Controlled Release》：Protein expression kinetics of mRNA, saRNA, and pDNA as individual or co-delivered payloads using a common lipid nanoparticle formulation

**摘要**

脂质纳米颗粒（LNPs）是已获临床验证的核酸药物载体，尤其适用于信使RNA（mRNA）的递送。除了mRNA之外，LNPs还可用于递送其他具有不同生物学特性的基因表达型核酸，为调控表达动力学提供了新的可能性。本研究比较了分别负载编码荧光素酶（FLuc）的mRNA、自我扩增RNA（saRNA）和质粒DNA（pDNA）的LNPs，以及这些载荷的预定义组合，以评估载荷身份和组成如何影响体外和体内的表达。

采用恒定的基于ALC-0315的脂质组成和微流控制备工艺，在恒定脂质组成下，单载荷LNPs在小鼠肌肉内和静脉注射后表现出不同的表达特征：mRNA产生高而短暂的表达水平，saRNA产生延迟且持续的表达，而pDNA则实现了延长的低水平表达。组合载荷制剂——无论通过将载荷在LNP制备前混合还是通过将单独制备的LNPs混合——所展现的表达特征与其各组分载荷的比例贡献一致，在实验条件下提供了加性行为的原理性证据，且未发现协同或拮抗作用的明确证据。

对LNP理化特性的表征，包括平均水动力学直径、多分散性、zeta电位和包封率，显示各制剂之间差异极小。这些结果表明，在所研究的共同制剂系统中，表达特征的差异与载荷的身份和组成相关。总体而言，本研究表明，当不同的核酸载荷通过共同的LNP制剂递送时，可以观察到不同的表达动力学，且在特定实验条件下，组合载荷制剂可以表现出加性的表达行为。

**引言**

脂质纳米颗粒（LNPs）是已获临床验证的核酸药物递送系统，已用于多种获批药物，其中最著名的是COVID-19 mRNA疫苗。LNPs通常由可电离脂质、磷脂、胆固醇和PEG化脂质组成，这些组分共同实现核酸的高效递送。LNPs保护核酸免受降解，促进细胞摄取，并实现胞质释放，从而克服裸核酸递送的关键障碍[1]。尽管目前获批的LNP制剂主要用于递送mRNA或siRNA，但LNPs也可递送具有不同结构和生物学特性的多种核酸载荷。

除了mRNA和siRNA之外，其他蛋白质编码核酸可提供不同的表达动力学、更好的稳定性或更低的免疫原性。因此，不断扩大LNP平台的功能范围以递送多种核酸载荷的兴趣日益增长[2,3,4,5]。从广义上讲，核酸药物可以分为驱动基因表达的类别，如mRNA，以及沉默或调节基因表达的类别，如siRNA。虽然mRNA在成功递送至细胞内后可以引发高水平的蛋白质表达，但由于mRNA的不稳定性，这种表达通常是短暂的。此外，mRNA以及体外转录（IVT）过程中可能产生的副产物，包括双链RNA和未加帽的5′-三磷酸物种，可能具有高度免疫原性[6,7]。这种免疫刺激特性对于疫苗应用可能有利，但在其他治疗背景下可能是不理想的，包括基因替代策略或某些癌症治疗。

因此，已探索了多种替代性基因表达核酸用于LNP递送，包括自我扩增RNA（saRNA）、环状RNA（circRNA）和质粒DNA（pDNA）。自我扩增RNA（saRNA）保留了mRNA的核心结构特征，但整合了来源于甲病毒的复制机制，能够实现细胞内的RNA复制，从而以较低的初始RNA剂量实现延长的蛋白质表达[2,8]。由于这种额外的复制机制，saRNA显著大于传统mRNA（通常为~9–12 kb，而mRNA为1–2 kb），并编码四种病毒非结构蛋白和一个驱动转基因表达的亚基因组启动子。这种增大的尺寸可能给LNP制剂和递送带来挑战，但也使得在显著低于mRNA的剂量下即可实现有效的蛋白质表达[2,9]。因此，较低剂量需求可能降低生产成本并改善基于RNA的疫苗的全球可及性[10]。临床研究还表明，自我扩增RNA疫苗可能影响人类体内的下游免疫结果。例如，与单纯mRNA疫苗相比，包含saRNA的疫苗接种方案与增强的抗体广谱性和CD8? T细胞反应相关联，这与抗原暴露动力学的改变一致，尽管未直接测量表达动力学[11]。同样，临床前研究表明，LNP制剂的saRNA在肌肉注射后可驱动体内抗原的强效表达和免疫激活，支持saRNA递送系统的转化潜力。然而，在许多此类研究中，表达是通过免疫原性终点推断而非直接随时间定量[12]。近期，自我扩增RNA疫苗已获批用于临床应用，可通过脂质纳米颗粒（如Kostaive（zapomeran；原为ARCT-154））或其他脂质系统递送[13,14]。随着这些平台的推进，日益需要理解载荷固有的生物学特性如何在独立于递送颗粒设计的情况下影响表达行为。

质粒DNA是另一种具有独特优势和局限性的替代性基因表达载荷。DNA疫苗自20世纪90年代以来一直在开发中，最初针对HIV，首个针对SARS-CoV-2的DNA疫苗在COVID-19大流行期间获批[15]。大多数DNA疫苗依赖裸质粒DNA或病毒载体，质粒DNA通常在没有专用递送载体的情况下给药。然而，在没有电穿孔等先进递送方法的情况下，高效的摄取和表达通常受到限制[15,16]，这促使人们探索非病毒递送系统，如LNPs。

与RNA相比，pDNA通常结构更稳定，可能在分发和长期储存方面提供实际优势[16]。然而，pDNA必须到达细胞核才能被转录，相对于在胞质中直接翻译的mRNA，这引入了额外的细胞内障碍。这一要求通常导致表达水平低于mRNA[17]。此外，尽管LNPs促进细胞摄取和胞质释放，但它们本身并不能提供高效的核递送。因此，LNP介导的pDNA递送预计在最有效的情况是分化的细胞中，因为细胞核膜临时破裂允许进入细胞核[18]。为了提高转录效率和核可及性，治疗性pDNA构建体通常被设计有特定的调控元件，如强启动子和能够减少非特异性重组或非预期基因组整合的序列特征[19,20]。重要的是，pDNA保持附加体状态，具有较低的基因组整合风险，能够在最小化插入致突变风险的情况下实现持续表达[16]。在疫苗接种的背景下，过长的抗原表达并不总是有利的，因为在慢性抗原刺激的情况下，持续的抗原暴露与T细胞耗竭和免疫调节改变相关联[21]。这突显了根据预期治疗应用调整表达动力学的重要性。

尽管对替代性核酸载荷的兴趣日益增长，但在同一LNP系统内直接比较mRNA、saRNA和pDNA的实验仍有限。此外，在共同的LNP制剂中同时纳入编码同一蛋白质的多种核酸格式的影响尚未进行系统研究。此类组合可以利用它们的互补表达特征，例如通过mRNA提供快速的初始表达，同时通过saRNA或pDNA实现更持续的蛋白质生产。在需要快速起效和持续生产同一蛋白质的应用中，这可能相关，包括蛋白质替代和再生疗法，或抗原表达持续时间正在被调控的疫苗。在许多现有研究中，载荷类型之间的比较受到递送系统、制剂参数或实验条件差异的混淆，使得难以区分载荷身份的贡献与载体的贡献。既往研究表明，制剂组成可以显著影响核酸递送和表达结果，使得使用不同系统制备的载荷之间的直接比较变得困难[2,22]。为解决这一问题，使用共同的LNP制剂和恒定的制造条件进行比较，为直接评估载荷依赖的表达行为提供了框架，同时最大程度地减少了制剂相关变量。

在本研究中，我们采用恒定制剂方法，比较了使用可电离脂质ALC-0315制备并负载编码荧光素酶（FLuc）的mRNA、saRNA或pDNA的脂质纳米颗粒的理化特性和生物学表现。通过保持恒定的LNP组成和制造工艺，我们在最大程度减少制剂组成引起的变异的情况下，比较了载荷身份对表达动力学的影响。这一原理性方法旨在直接比较恒定制剂条件下载荷依赖的行为，而非确定每种核酸模态的最优制剂。我们评估了体外和通过小鼠体内延长研究的表达特征，从而评估表达水平和动力学。此外，我们还研究了通过将载荷在LNP制备前混合或通过将单独制备的LNPs混合而产生的组合载荷制剂，以探索组合策略如何影响颗粒特性和表达行为。作为这一原理性评估的一部分，我们还评估了结果表达特征是否与实验条件下各独立核酸的加性贡献一致。

**材料**

以下材料由Avanti Research提供（Croda品牌，美国阿拉巴马州阿拉巴斯特市）：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）、1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基（聚乙二醇-2000）（DMG-PEG 2000）、甲氧基聚乙二醇氧基（2000）-N,N-二十八烷基乙酰胺（ALC-0159）和[(4-羟基丁基)二氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)（ALC-0315）。

编码FLuc的mRNA（货号：MP01CCAGm1pU）和自我扩增RNA（saRNA；货号：ST01CCAUNM）购自UBC RNA。

**比较单载荷LNPs递送的mRNA、saRNA和pDNA**

核酸负载的LNPs通过微流控混合制备，使用ALC-0315作为可电离脂质，分别包封mRNA、saRNA或质粒DNA（pDNA）。我们使用固定的N/P比为6和相同的脂质组成进行所有制剂，以确保观察到的任何理化特性或生物学表现差异可归因于核酸载荷而非制剂变量。

首先基于其理化特性比较LNPs制剂。

**结论**

本研究在单一、具有临床相关性的LNP系统内直接比较了mRNA、saRNA和pDNA，能够直接评估载荷依赖的表达动力学效应。我们表明，当保持组成恒定时，LNP介导的表达特征主要由核酸身份而非制剂差异决定，mRNA、saRNA和pDNA表现出独特且互补的表达行为。关键的是，当组合在单个……

**CRediT作者贡献声明**

Caitlin McMillan：写作——审阅与编辑、写作——初稿、方法论、调查研究、形式化分析、数据整理、概念化。Muattaz Hussain：写作——审阅与编辑、写作——初稿、调查研究、数据整理。Panida Punnabhum：写作——审阅与编辑、写作——初稿、形式化分析、数据整理。Andrew J. Varley：写作——审阅与编辑、写作——初稿、资源。Kristen Y.S. Kong：写作——审阅与编辑、写作——

**伦理**

**机构审查委员会声明**：所有动物实验均按照英国内政部《1986年科学程序动物法》的《实验动物护理和使用指南》进行，并符合内部伦理委员会和英国政府批准的项目许可证（项目许可证PP1650440；批准日期：2020年5月29日）。

**资金**

本研究由BBSRC和CRODA资助（BB/X511006/1）。

**利益冲突声明**

本研究获得BBSRC（BB/X511006/1）、Avanti Research（AD）和UBC制剂核心支持。AD是Avanti Research的员工，AV和KY隶属于UBC制剂核心。其他所有作者声明不存在竞争性经济利益。研究设计、数据收集、分析和解释均由作者独立进行。作者声明研究是在没有任何可能被解读为……的商业或财务关系的情况下进行的。

**致谢**

我们感谢苏格兰大分子成像中心（SCMI）的James Streetley、Debakshi Mullick、Giuseppina Briola和Gonzalo Cebrero Acuna在低温电镜实验和仪器使用方面的协助，相关研究由MRC（MC_PC_17135, MC_UU_00034/7）和SFC（H17007）资助。

Caitlin McMillan | Muattaz Hussain | Panida Punnabhum | Andrew J. Varley | Kristen Y.S. Kong | Zahra Rattray | Amy Druschitz | Yvonne Perrie