在mRNA递送中缓冲细胞应激实现免疫调节性白细胞介素-2（IL-2）治疗

《Journal of Controlled Release》：Buffering cellular stress during mRNA delivery enables immunoregulatory interleukin-2 therapy

姜黄素（curcumin）修饰的mRNA（messenger RNA）载体抑制转染诱导的应激和炎症。姜黄素增强聚合物-mRNA组装并改善全身转染。应激缓冲的IL-2（interleukin-2）mRNA递送使低剂量IL-2介导的免疫调节成为可能，并改善结肠炎。

信使RNA（messenger RNA，mRNA）治疗已成为免疫治疗平台。研究人员指出，临床转化主要利用其放大免疫激活的能力，如癌症疫苗、细胞因子治疗、免疫检查点调节和体内嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）工程。在这些应用中，治疗效果常受益于mRNA递送伴随的促炎环境。但将mRNA技术扩展至需要免疫耐受的应用仍相对不发达。核心挑战在于，大多数mRNA递送策略破坏细胞内稳态，激活先天免疫传感器和细胞应激反应通路；这些反应虽可增强疫苗和抗肿瘤免疫，却造成内在免疫刺激偏倚，限制mRNA免疫调节治疗的理性设计。为降低这种偏倚，已有策略包括mRNA化学修饰、非翻译区（UTR）优化、纯化，以及采用低免疫原性脂质、调节内体破坏、共递送糖皮质激素地塞米松等。但仍存在挑战：细胞对递送的反应超出明显免疫识别，包括氧化应激（oxidative stress）和炎性小体激活（inflammasome activation），现有方法不能完全缓解；这些通路可促进共刺激分子、促炎细胞因子及活化或免疫原性细胞状态，削弱免疫调节信号。因此，需要直接缓解mRNA递送相关应激，而非仅抑制免疫激活。研究人员报告一种应激缓冲聚合物纳米载体平台，将姜黄素整合入载体架构用于mRNA递送，利用其调节细胞内应激反应包括氧化和炎症通路。该纳米载体维持mRNA血清稳定性并实现有效胞质释放，在细胞内将应激动态从促炎放大转向受调控适应状态，抑制应激相关细胞因子。为展示潜力，研究人员聚焦多效细胞因子白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2），其可依炎症背景刺激效应T细胞或扩增调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）。传统mRNA载体常诱导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-1β，增强IL-2依赖T细胞活化，通过促进IL-2受体（IL-2R）表达和增殖，利于效应而非调节反应。相反，应激缓冲递送实现受控全身IL-2表达，选择性扩增Treg而无明显效应活化。在结肠炎小鼠模型中，该方法逆转疾病，恢复免疫平衡并控制炎症。通过直接处理递送诱导细胞应激的更广泛不利效应，该策略扩展mRNA治疗范围，为需保留低应激胞内环境的应用提供通用平台。该论文发表在《Journal of Controlled Release》。

为开展研究，研究人员模块合成聚乙二醇-聚L-赖氨酸（poly(ethylene glycol)-poly(l-lysine)，PEG-pLL）主链，经3-羧基-4-氟苯硼酸（3-carboxy-4-fluorophenylboronic acid，FPBA）连接姜黄素形成PEG-pLL(Cur)，选择PEG-pLL(Cur)₂₅与mRNA复合，制备Cur-PIC₅和Cur-PIC₁₀，并以PIC₅、PIC₁₀为对照。细胞为小鼠巨噬细胞RAW264.7，来源于Riken BioResource Center；动物为雌性BALB/c小鼠，来源于Charles River Japan。主要关键技术包括动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、荧光相关光谱（FCS）、荧光共振能量转移（FRET）、分子动力学（MD）模拟、qPCR、DPPH抗氧化 assay、乳酸脱氢酶（LDH）膜破坏检测、流式细胞术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、活体共聚焦激光扫描显微镜（IVCLSM）、活体成像系统（IVIS），以及硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导结肠炎模型。

在结果部分，2.1 聚合物结构在胶束中稳定mRNA。通过模块合成、DLS、TEM、FCS、FRET和MD模拟，PEG-pLL(Cur)₂₅与mRNA在L/P=5和10形成单分散约90 nm胶束，姜黄素增强聚合物-mRNA相互作用，Cur-PIC在DSS存在下保持完整，而PIC易解离。2.2 协调mRNA稳定性、释放和氧化还原控制。通过MD、光谱、qPCR、FCS、DPPH和H₂O₂细胞实验，PEG-pLL(Cur)保留与核糖核酸酶（RNase）结合并抑制RNase介导mRNA降解；硼酸酯键在酸性pH释放姜黄素并促进mRNA释放；Cur-PIC具抗氧化能力并减少氧化应激细胞死亡。2.3 Cur-PIC促进mRNA转染。通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA、Cy5标记mRNA、LDH和巴弗洛霉素A1（Baf-A1）处理，Cur-PIC细胞毒性低，提高细胞摄取和内体逃逸，呈现pH依赖膜破坏，转染效率高于PIC，L/P=10达饱和。2.4 Cur-PIC缓冲细胞应激。通过H₂DCFDA、caspase-1流式、碘化丙啶（PI）染色、ELISA、CD80/CD86流式和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理，Cur-PIC降低活性氧（ROS）、caspase-1活化、膜通透性及IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10分泌至接近未处理水平，不显著激活巨噬细胞；ROS清除对抑制炎症重要。2.5 Cur-PIC增强全身mRNA递送效率。通过IVCLSM、qPCR、体内FRET和IVIS，Cur-PIC改善血液循环稳定性，保留完整mRNA，肝转染较PIC高两倍以上，Cur-PIC₁₀优于Cur-PIC₅。2.6 细胞应激缓冲使IL-2 mRNA介导的治疗性免疫调节成为可能。通过高剂量Luc mRNA、IL-2 mRNA、流式细胞术和DSS结肠炎模型，Cur-PIC不引起明显全身炎症，诱导较低但有效IL-2，升高IL-10，扩增CD4⁺Foxp3⁺ Treg而不改变CD8⁺ T细胞；在结肠炎中减轻体重下降，增加结肠长度，改善H&E病理，抑制IL-1β、TNF-α、IL-6，增加肠系膜淋巴结Treg，效果归因于IL-2表达。

讨论部分总结：研究人员认为，缓冲mRNA递送中的细胞应激可保留IL-2免疫调节活性，选择性扩增Treg而不激活效应应答；结肠炎模型中恢复免疫平衡并解决炎症，显示治疗潜力。Cur-PIC应激调节机制为低免疫原性mRNA载体设计提供框架。与糖皮质激素地塞米松等策略相比，后者存在剂量依赖性降低mRNA表达、糖皮质激素泄漏或重复给药风险以及未完全抑制ROS驱动炎症等问题。炎症反应在内体处理早期开始，ROS生成和内体逃逸膜损伤参与。Cur-PIC高效清除ROS，维持内体逃逸同时最小化应激，重复给药后细胞因子近背景水平。低炎症递送有利于免疫调节信号。基于姜黄素的应激缓冲可适应其他载体包括脂质纳米颗粒（LNP）。姜黄素还改善理化性能，疏水平面结构增强聚合物-mRNA相互作用，RNase抑制保护货物。将生物活性结构元件直接整合入递送材料优于共施，确保共定位和同步活性。局限是体外机制主要依赖RAW264.7，可能不完全再现肝细胞、Kupffer细胞和内皮细胞对肝炎症反应的贡献；体内完整肝微环境仍显示应激缓冲。未来需多细胞模型、增强转染效率、优化聚合物主链和嵌段结构。该工作建立设计原则：应激调制作为mRNA递送核心功能元件；许多mRNA编码蛋白对细胞状态和信号背景敏感，递送诱导应激可能是mRNA治疗应用变异的普遍来源，可通过应激缓冲降低，改善安全性和生物保真度。

研究结论部分翻译：在mRNA递送过程中缓冲细胞应激能够保留免疫调节性IL-2活性，选择性扩增Treg细胞而不激活效应应答；在结肠炎模型中，该方法恢复免疫平衡并消除炎症，展现治疗潜力。这些结果确立应激缓冲作为纠正递送诱导免疫偏倚并使能免疫调节性mRNA治疗的策略。该工作还建立将应激调制视为mRNA递送核心功能元件的设计原则，递送诱导应激可能是mRNA治疗应用变异的普遍来源，可通过应激缓冲降低，从而提高表达治疗剂的安全性和生物保真度。