不同二氧化碳和氧气浓度下结合pH循环的海洋藻类Picochlorum celeri的生物质生产率

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Biomass Productivity of the Marine Alga Picochlorum celeri at Different Carbon Dioxide and Oxygen Concentrations with pH Cycling

　　

• 培养基pH值被用作ΔCO?的相关指标，通过在离散pH值处测量ΔCO?来实现。
• 室内生物反应器通过类似的CO?供给方案模拟户外培养。
• pH值高于7.8会降低Picochlorum celeri的生产率。
• pH循环提供了较高的生产率和预测的高碳利用效率。
• P. celeri中很可能存在一种基本的碳浓缩机制。

**引言**

微藻在食品、饲料、燃料、肥料和生物材料的生产中具有应用前景，并且可以在不适合农业的水源中培养[1]、[2]、[3]。目前，高资本成本和运营成本是限制该技术发展的主要因素，其中大部分是由于CO?的费用[4]、[5]。为了降低大规模藻类培养的预计成本，本文呈现了在多种CO?和O?浓度条件下快速生长的海洋微藻Picochlorum celeri TG2生产率的实验数据。这些数据首次对P. celeri在设定（高/低）O?浓度下的pH循环进行了综合评估，同时也首次对户外观察到的CO?动态进行了光生物反应器模拟。施加pH循环方案是为了模拟大型户外跑道池中占主导地位的条件，在这些条件中O?在碳化站之间积累，而CO?浓度下降。这些信息有助于确定池塘中必要的pH制度（成本高昂的碳化站频率），以实现高生产率和高碳利用效率（CUE）。使用实验室光生物反应器（PBR/生物反应器）来确定在维持高藻类生物量生产率的同时最小化CO?投入的pH运行制度。

室内生物反应器可以复制相关的户外生长参数，特别是光照和温度，并且由于成本远低于户外培养运行且通量更高，是菌株筛选和工艺开发的有用工具[6]。然而，实验室生物反应器通常向剧烈搅拌的藻类培养物中通入大量空气和CO?，避免了碳限制和光合作用产生的O?抑制。这与大型培养池不同，后者在跑道沿线离散位置输送CO?，导致培养物流经每个碳化站时pH范围相对较大。此外，相对于光合作用产生的O?，O?排出缓慢，使池塘中溶解O?浓度增加至超过空气平衡水平的数倍[5]、[6]、[7]。在模拟池塘环境的室内生物反应器中，O?和CO?浓度的动态变化很少被一起研究，这限制了对大型池塘生产率的准确预测。

CO?是藻类生物量生产中的一个主要成本，需要高效输送和利用。开放式跑道池微藻培养需要CO?以匹配其利用速率的速率输送，以最小化池塘中传输和溢出的损失。目前，用于微藻生产的主要CO?来源是本质上纯的CO?，来自发酵、氨生产和其他工业来源。发电烟气中的CO?在微藻培养应用中也有潜力。虽然在一座大型微藻设施中使用过[8]，但利用烟气CO?的商业化生产尚未成功实现。无论来源如何，经济可行的工艺通常需要超过70%的高CUE。CO?从藻类群体培养中的损失发生在向培养物转移的过程中，最关键的损失来自于藻类培养物的溢出排放。溢出排放发生在白天（此时供应CO?以支持光合作用）和夜间（此时藻类细胞的呼吸作用产生可能逸散到大气中的CO?）。高CUE需要微藻生长过程中快速碳摄取和低夜间呼吸速率[9]。

pH值、CO?供给、藻类生长、溢出排放和CUE之间的关系此前已被研究[6]、[10]、[11]、[12]、[13]。CO?实际上无法在整个大型池塘区域供应。因此，CO?必须在空间分离的离散注入门站提供，并以溶解无机碳（DIC）的形式供微藻利用。因此，大型跑道藻池中的pH值、CO?和DIC浓度在输送站之间动态循环。当生长培养基通过CO?注入门站时，pH值下降，然后随着藻类光合作用利用可用的DIC而持续上升，细胞沿池塘通道以基本活塞流的方式移动到下一个CO?输送站。

关于pH循环条件下藻类生产率的文献数据有限。一种Ankistrodesmus sp.在恒定pH 7.0和8.7以及pH从6.5循环到9.5时，分别产生了19、14和16 g·m?2·d?1 AFDW[10]。这些实验在室内1.4 m2跑道迷你池塘中进行，使用金属卤化物灯（20-25%的夏季日照输入，14:10光暗周期和20 mEq/L碱度，TDS约5 g/L）。在pH 9.5时，CO?浓度大致等于空气平衡，而在pH 8.7时约为80 μM，足以避免碳限制，但仍导致生产率降低，可能是因为高pH。一种Cyclotella物种的生产率在恒定7.2 pH（19.3 ± 4.8 g·m?2·d?1）与恒定8.3 pH（18.7 ± 5.5 g·m?2·d?1）之间没有变化[12]，这是在1988年6月和7月在新墨西哥州罗斯韦尔两个重复的3 m2户外池塘中进行的为期39天的实验[14]。当在同一系统中将pH从7.2循环到8.3时（1988年7-8月，n=34，TDS 18ppt），生产率为18.2 ± 6.3 g·m?2·d?1，与恒定pH = 7.2时的19.5 ± 4.7 g·m?2·d?1相比。在pH 7.2时CO?浓度为300 μM，在pH 8.3时为20 μM。虽然这些结果在配对t检验中统计显著，但数值上并无实际差异。在pH 8.3时，20 μM的CO?可能不够低以至于降低藻类生产率。也有可能在较低pH下的生产率受温度限制，未能达到在较低pH下可能达到的水平。总之，先前的研究无法得出关于pH、DIC和CO?供给影响的明确结论。

碳化站是主要的资本和运营成本[15]、[16]，池塘设计必须针对碳化站之间最大的pH变化进行优化，同时考虑到高pH下的生产率损失。假设CO?在户外仍为限制性底物，在pH循环过程中优化微藻生长必须平衡循环pH低端时快速溢出和高pH端的生产率下降。这两个过程——藻类摄取和溢出排放——之间存在对培养基中CO?的竞争。微藻摄取CO?的速度相对于溢出速率越快，CUE就越高。

藻类培养物在生长过程中释放O?，通常使藻池中的溶解氧（DO）水平增加到空气饱和值的百分之数百[6]、[17]、[18]，不同藻类物种对高DO水平的耐受性不同[11]，以及对pH和碱度的耐受性也不同。当在97% O?/3% CO?的气氛下（与97%空气/3% CO?相比）培养时，一种Scenedesmus sp.的生产率降低了20-30%，而一种Chlorella sp.降低了80%，尽管两种培养物在返回空气/CO?时都能快速恢复。一种Ankistrodesmus sp.在O?/CO?下经过两个批次生长周期后丧失了50%的生产率，且当切换回空气/CO?时未能恢复。一种Oocystis sp.在高O?下丧失了超过85%的生产率。在1.4 m2户外池塘中，两种Chaetoceros sps.、一种Cyclotella sp.和一种Tetraselmis suecica在允许DO增加与通过空气鼓泡去除O?时，生产率几乎没有降低[12]。开发了一种筛选方案，在低辐照度（185 μE·m?2·s?1，24小时照明）条件下，在空气/CO?或O?/CO?气氛下培养实验室培养物，以测试O?敏感性。在高O?下最大比生长速率几乎没有下降且平均生产率下降不到20%的培养物在户外培养中表现稳定。表现出更多O?抑制的培养物无法在户外池塘中维持。总之，池塘中的高O?目前不可避免，但这些不利影响可以通过更具O?耐性的藻类菌株来克服。

藻类生产率也会因夜间呼吸而损失，CO?从池塘中溢出可能降低总体CUE。然而，关于夜间呼吸的数据在不同研究之间差异很大，范围从白天生产率的不到5%到超过20%[9]。在户外生长实验中，Laws和Berning（1991）[19]测量到夜间25%的生物量损失，而Doucha和Lívansky（2006）[20]报告的损失较低，为6-14%。在5-42°C温度下黑暗中的O?消耗量测量值为最大O?产生速率的4.5至2.7%（Bechet等人，2015）[21]。更详细的夜间pH测量将有助于更好的建模和估算。Caia等人（2018）[22]的敏感性分析得出结论，减少夜间呼吸可能使CUE提高10%，但这高度依赖于模型假设。

Picochlorum celeri TG2因其快速生长速率和高海水生物量生产率而备受关注。据报道，户外单日生产率超过40 g AFDW·m?2·day?1[7]，连续三年的夏季平均生产率为32、24和29 g AFDW·m?2·day?1[7]、[23]、[24]。然而，这些实验和迄今为止的大部分实验都使用了生长饱和的CO?（~pH 7）和低到中等的O?浓度。本研究的实验首次在生物反应器中设计，通过定制光照、CO?和气体输送时间表来模拟大型户外跑道池中培养物在碳化站之间移动时循环的CO?（因此也是pH）水平。此外，实验以95% O?、空气或仅CO?作为鼓泡气体进行，以量化高O?水平对生产率的影响。

**实验章节片段**

**实验室生物反应器的培养基和接种物制备**

使用商业人工海水混合物Instant Ocean?，以40 g/L浓度添加至藻类培养基中，以模拟35 ppt的海水盐度。添加的宏量营养素包括15.0 mg/L FeSO?-7H?O（从2 g/L FeSO?•7H?O和2.7 g/L EDTA二钠盐的储备溶液中添加）、218 mg/L尿素和44.5 mg/L KH?PO?。微量营养素从浓缩储备溶液中添加至最终浓度为0.314 mg/L MnSO?•1H?O、0.0242 mg/L CoCl?•6H?O、0.0488 mg/L ZnSO?•7H?O、0.002 mg/L CuSO?•5H?O。

**池塘建模**

如上所述在第2.4节中，一个用于估算碳动态的模型[6]被进一步开发以与实验数据相关联，阐明碳利用和损失的主要问题，以支持研究计划的发展，其中pH值被用作与ΔCO?相关联的控制变量。培养物中ΔCO?的浓度决定了因溢出排放而导致的C损失。光合作用对C的摄取速率以及由TA提供的缓冲作用随后在模型中决定……

**微藻培养中的CO?动态**

太阳模拟PBR以三秒的采样频率追踪CO?输入和pH值。这些数据和一个碳酸盐平衡系统模型可用于计算藻类CUR和溢出排放速率，从而允许在比AFDW测量可能的时间尺度短得多的时间范围内预测微藻生长，在AFDW测量中样本采集还会使生产率计算复杂化。如表7所示，使用CUR（通过追踪pH随时间变化）计算日生产率的局限之一是……

**结论**

本研究在循环pH（DIC）和高O?条件下测量了P. celeri TG2的光合生产率，这些条件与大型池塘相关。恒定pH下的高和低DO生长实验显示了O?在昼夜生长过程中对生产率的直接影响。存在广泛的pH和DO范围，在此范围内可实现高生产率生长。当CO?接近大气平衡时，生长速率开始下降。重要的是，在空气水平的氧气条件下，细胞在pH 8.1时仍保持生产率。这……

**CRediT作者贡献声明**

John R. Benemann：撰写——审阅与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取、概念构思。Juan Martinez：调查、形式分析、数据整理。Matthew C. Posewitz：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源、项目管理、资金获取、形式分析、概念构思。Yasin Torres-Tiji：可视化、形式分析、数据整理。Devin A.J. Karns：撰写——审阅与编辑、可视化。

**利益冲突声明**

作者声明他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本文所报告的工作。

**致谢**

作者感谢美国能源部生物能源技术办公室（BETO）（DE-EE0010292）的支持。

我们感谢科罗拉多大学博尔德分校电子显微镜服务中心的 Garry Morgan 和 Sarah Zimmermann 为本研究拍摄电子显微镜图像。部分工作是在以下核心设施完成的，该设施是科罗拉多矿业学院共享仪器设施水质分析的一部分：SCR_025080。特别感谢科罗拉多矿业学院的 Thayne S. Ekness、Devin A.J. Karns、Yasin Torres-Tiji、Daniel MacLaughlin、Braden Crowe、Juan Martinez、John R. Benemann、Matthew C. Posewitz 和 Joseph C. Weissman。