《Journal of Immunological Methods》：Qualification of ELISA and PRNT methodologies to measure RSV humoral immunity using human clinical samples
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摘要呼吸道合胞病毒（RSV）在全球范围内构成重大公共卫生负担，主要导致5岁以下儿童和65岁以上成人的下呼吸道感染。近年来，疫苗和单克隆抗体（mAbs）在易感人群中展现出对RSV的有效预防作用，使个体、家庭及医疗系统受益。然而，这种保护作用并不完全，凸显了持续研发新型和改进疗法
摘要
呼吸道合胞病毒（RSV）在全球范围内构成重大公共卫生负担，主要导致5岁以下儿童和65岁以上成人的下呼吸道感染。近年来，疫苗和单克隆抗体（mAbs）在易感人群中展现出对RSV的有效预防作用，使个体、家庭及医疗系统受益。然而，这种保护作用并不完全，凸显了持续研发新型和改进疗法的重要性。具有临床资质的终点检测方法是这些研究工作中的关键工具，使研究人员能够深入了解机体对RSV抗原体液免疫反应的幅度、组成及中和效力。本文描述了两种相关RSV检测方法的方法学及临床资质认定，分别是酶联免疫吸附测定（ELISA）和蚀斑减少中和试验（PRNT）。我们证明每种检测方法均具有精确性、线性及转化适用性。公开可用的对照品提高了检测结果的可重复性和在不同实验室间的可转移性。
引言
呼吸道合胞病毒（RSV）是全球最常见的病毒性呼吸道感染之一，对早产婴儿、幼儿、老年人和免疫功能低下人群构成重大公共卫生负担（Kaler等，2023）。RSV分为A型和B型两个亚型，二者共同流行，均可引起下呼吸道感染和毛细支气管炎，估计全球每年病例数至少达3300万例（Nuttens等，2024）。仅在美国，2024年10月至2025年4月流行季期间，RSV导致约15,000人死亡、250,000人住院，以及470万次门诊就医，主要影响5岁以下儿童和65岁以上成人（Carter等，2026）。RSV是一种有包膜的RNA病毒，基因组约15 kb，编码11种蛋白，其中两种——G蛋白和F蛋白——分别参与病毒颗粒与呼吸道上皮细胞的附着及与宿主细胞的融合（Kaler等，2023）。F蛋白存在于两种构象中：前融合态（pre-F）和后融合态（post-F）；构象变化介导融合并形成合胞体——RSV特征性的多核融合细胞，病毒在其中进行复制（Van Royen等，2022；Lu等，2002）。
F蛋白和G糖蛋白均代表病毒体表面的主要抗体中和靶点（Anderson等，2021），其中F蛋白高度保守，仅在前融合三聚体的抗原表面上存在有限的氨基酸序列异质性（Nuttens等，2024）。相比之下，G蛋白是RSV蛋白质组中变异最大的蛋白（Anderson等，2021），其跨多个黏蛋白样结构域存在大量异质性（Nuttens等，2024），由此产生了A和B两个不同亚群，增加了治疗候选物设计和评价的复杂性。尽管如此，目前关于G蛋白作为中和抗原靶点的研究正在蓬勃兴起（Bergeron等，2021），但F蛋白长期以来一直是RSV预防研究的主要焦点，至今仍然如此。最近的结构和免疫学数据揭示，前融合态构象上中和表位的丰度高于后融合态，进一步巩固了其作为疫苗设计和RSV免疫学表征主要靶点的角色（Yang等，2024）。本文主要以前融合抗原作为免疫靶点，但在一组数据中 opportunistic 地评估了后融合抗原。免疫球蛋白（Ig）G和IgA均参与抗前融合免疫反应；循环体液免疫反应主要由IgG驱动，而黏膜中的IgA似乎能够提供针对病毒进入呼吸道的强效且持久的一线保护（Habibi等，2015）。因此，本研究中评估的目标检测方法同时检测了IgG和IgA。
具有临床资质的、高通量的检测方法，用于评估RSV体液免疫反应的幅度、组成和中和效力，特别是针对F蛋白且在相关人群中的反应，是评估现有和新型RSV预防和治疗候选物的关键终点指标。酶联免疫吸附测定（ELISA）和蚀斑减少中和试验（PRNT）是互补的、定义明确的终点检测方法；ELISA在评估个体或分组免疫球蛋白类别针对特定抗原的亲和力方面具有重要价值，而PRNT是量化功能性抗病毒免疫反应的金标准。二者结合可提供免疫反应的全面图景，并有助于预测相关的宿主-病原体相互作用。本文描述了两种RSV终点检测方法的方法学及临床资质认定：终点效价ELISA用于评估针对A型和B型RSV前融合F的IgG和IgA特异性反应，以及针对后融合F的IgA特异性反应；以及使用B型RSV的PRNT50方法用于评估抗RSV抗体的功能性中和效价。这套检测方法可重复、精确、线性、高通量且具有临床相关性，有益于疫苗研发管线，并有助于满足全球对标准化RSV结局报告的需求。
章节摘要
标本和对照品
获取了具有不同程度抗RSV体液免疫水平的商品化人血清样本，用于方法开发和质量认定。由于普通人群暴露频率较高，健康成人中抗RSV体液免疫几乎普遍存在（Van Der Plas等，2020）；因此，使用商业化的抗体 depleted 样本作为阴性对照。表1详细列出了本次资质认定中所使用的样本和对照品。描述和
精密度
通过运行间变异评估了板间和板内变异。共16个样本，包括Ig depleted 血清、混合对照品和WHO标准品，分别由单一操作者在三个不同日子（日间）运行、由单一操作者在同一天（日内）运行、以及由三位不同操作者在同一天（操作者间）运行。每次运行中每个样本均以三重平行方式检测。终点效价按前述方法计算。对每个样本的IgA进行了评估
结论
本文描述了两种稳健的方法学，已具备对RSV体液免疫反应进行评估的临床资质，可直接应用于临床环境。EPT ELISA和PRNT检测方法均被证明具有精确性、线性，且能够检测跨不同年龄组的样本。ELISA测试还证明了其对F蛋白的特异性。这些检测方法可以可靠地跨不同日期和操作者使用，用于衡量临床疫苗候选物的有效性。
附加信息
所有作者声明与本手稿所述数据不存在财务或其他竞争性利益关系。
CRediT作者贡献声明
Matthew H. Harband：撰写——初稿、可视化、方法论、调查、正式分析、概念化。Tiffany Pecor：撰写——初稿、可视化、方法论、调查、数据管理。Zhiyi Zhu：撰写——审阅与编辑、方法论、调查。Bryan J. Berube：撰写——审阅与编辑、方法论、概念化。Thomas Smytheman：撰写——审阅与编辑、调查。Sasha E. Larsen：撰写——初稿、监督、项目
致谢
作者感谢西雅图儿童研究学院领导层的指导、关怀和导师支持。
本研究得到以下机构资助支持：美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）（隶属美国国立卫生研究院），资助编号
Matthew H. Harband|Tiffany Pecor|Zhiyi Zhu|Bryan J. Berube|Thomas Smytheman|Sasha E. Larsen|Rhea N. Coler
