人源甜菜碱/γ-氨基丁酸转运蛋白1的底物识别、构象转变与三钠离子耦合转运机制

《Cell Discovery》：Structural basis of the transport mechanism of hBGT1

　　

在肾脏和肝脏中，甜菜碱/γ-氨基丁酸（GABA）转运蛋白1（BGT1）转运甜菜碱以维持肾髓质细胞渗透平衡，并降低同型半胱氨酸蓄积的毒性；在脑中，BGT1将突触间隙中的GABA回摄取入胶质细胞以终止GABA能信号传导。尽管其具有重要功能，BGT1的底物识别与离子耦合分子机制仍不清楚。研究人员解析了BGT1分别与两种底物GABA和甜菜碱结合的冷冻电镜（cryo-EM）结构，以及无外源底物添加的底物游离态结构。底物结合复合物揭示了BGT1识别化学结构不同的GABA与甜菜碱的机制；这些结构被捕获于闭塞（occluded）和内向开放（inward-open）状态，阐明了构象转变的结构基础。此外，研究人员提出一个Na3结合位点，并探讨该Na3位点在限制反向转运和促进底物蓄积中的功能作用。这些认识增进了对BGT1及其他神经递质转运蛋白中底物识别、构象转变和离子耦合机制的理解。

研究背景方面，BGT1属于溶质载体家族6（SLC6）中的GABA转运蛋白（GAT）亚族，依赖Na⁺和Cl^?完成协同转运。在肾髓质，BGT1蓄积甜菜碱以对抗高渗；在肝脏，甜菜碱经BGT1进入肝细胞后向同型半胱氨酸提供甲基生成甲硫氨酸；在脑内，BGT1主要分布于星形胶质细胞，回摄GABA并参与癫痫等病理过程。已有GAT1、去甲肾上腺素转运蛋白（NET）、多巴胺转运蛋白（DAT）、5-羟色胺转运蛋白（SERT）等神经递质/钠同向转运蛋白（NSS）结构被解析，但它们通常利用2个Na⁺和1个Cl^?；BGT1则协同转运3个Na⁺，第三钠离子结合位点长期未明。同时，GAT1–3仅转运GABA，而BGT1可同时转运GABA与甜菜碱，其双底物选择性的结构基础未知。因此，阐明BGT1底物识别、构象循环与Na₃耦合机制具有重要生理与药理意义。该论文发表于《Cell Discovery》。

关键技术方法方面，研究人员以HEK293F细胞表达全长野生型人BGT1，将蛋白重构成由脑极性脂质与MSP1D1E3组成的纳米盘，利用300 kV Titan Krios与K3探测器的冷冻电镜单颗粒技术，分别在有10 mM GABA、20 mM甜菜碱及无外源底物条件下解析BGT1结构；并采用[³H]GABA摄取实验、点突变、饱和摄取、反向转运及钠依赖曲线评估功能。

研究结果如下。结构测定与BGT1架构：研究人员解析BGT1与GABA、甜菜碱及内向开放态结构，分辨率分别为2.7 ?、2.6 ?和3.2 ?；BGT1具有经典LeuT样折叠，含12个跨膜螺旋（TM），TM1与TM6中段去折叠并形成底物与离子结合核心，N端1–42与C端585–614因无序未观测。底物结合与选择性：GABA通过G57^TM1、Y133^TM3、Q299^TM6、S395^TM8等氢键网络结合；甜菜碱的季铵基与E52^TM1形成盐桥；Q299^BGT1对应GAT1–3为亮氨酸，其亲水性环境使BGT1可容纳甜菜碱，TM3与TM8外倾也增加结合腔空间。离子结合：Na1、Na2与Cl^?位点保守；研究人员在TM2、TM3、TM6间发现球状密度并提出Na₃位点，由E93^TM2、S104^IL1、W108^IL1、S122^TM2、G300^TM6、T303^TM6、E468^TM10及水介导配位；S122A引发反向转运与饱和蓄积下降，证明Na₃可抑制反向转运并增强底物蓄积。细胞内与细胞外闸门：R61^TM1、Y64^TM1、T289^TM6、Q290^TM6、D452^TM10、S457^TM10封闭胞外通路；E52^TM1从甜菜碱态、GABA态到内向开放态逐步远离TM6，TM1a角度增大并去折叠，实现occluded到inward-open转变。胆固醇结合位点：研究人员发现CHOL1（CHS介于TM3/TM4，R195^EL2关键）与CHOL2（TM9/TM10/TM12沟槽），主要起结构稳定作用而非直接调控转运。

讨论部分总结：研究人员指出GABA与甜菜碱共用同一中央腔，水分子分布变化参与双底物容纳；Q299亲水侧链与E52保守性是BGT1双底物能力关键；组织差异主要源于底物可得性而非结合开关。Na₃破坏会导致反向转运与渗透调节受损。胆固醇位点位于支架螺旋，偏重稳定。该研究系统阐明BGT1底物识别、构象与离子耦合。

结论部分翻译：本研究中，研究人员解析了野生型BGT1的高分辨率结构，揭示了底物结合与构象转变机制，并鉴定了Na₃位点及两个潜在胆固醇结合位点。内源性底物GABA与甜菜碱结合于BGT1同一中央腔，结合姿态几乎相同，底物结合互作相似但参与识别的水分子不同；研究人员提出水分子分布变化在结合腔容纳不同底物中起关键热力学作用。BGT1可摄取甜菜碱，序列与结构分析表明Q299可能是其转运甜菜碱选择性的关键残基；与GAT中其他转运蛋白的疏水亮氨酸不同，Q299的亲水性在底物结合腔中形成更利于甜菜碱结合的亲水空间。E52侧链羧基与甜菜碱季铵正电荷形成静电作用而稳定结合。BGT1共转运三个钠与一个氯每底物，不同于其他GAT的1:2:1（底物:Na⁺:Cl^?）；潜在Na₃由E93^TM2、S104^IL1、W108^IL1、S122^TM2、G300^TM6、T303^TM6与E468^TM10配位，水介导配位对Na₃功能完整至关重要，破坏该位点会出现反向转运与饱和蓄积下降。结构捕获occluded与inward-facing构象，胞外通路被氢键网络封闭，E52^TM1与Q299^TM6借水分子封住胞内通路；GABA结合结构处于中间态。CHOL1依赖R195与CHS羧基静电作用，生理条件下胆固醇可能不结合；CHOL2为SLC6家族共有，主要稳定结构。总之，研究人员阐明了BGT1与两种底物结合的occluded态及无外源底物的inward-facing态，揭示底物识别、构象转变与离子耦合机制，尤其凸显Na₃结合位的生理作用。